单细胞转录组测序揭示了动脉粥样硬化免疫细胞的异质性
动脉粥样硬化中的免疫细胞包括 T、B、NK 和 NKT 细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、中性粒细胞和肥大细胞。单细胞转录组测序（scRNA-seq）技术的进展使我们对免疫细胞亚群的认识更加完善。最近的研究已经在人类动脉粥样硬化病变和 PBMC 样本中使用了免疫细胞的 scRNA-seq，研究证实了已知的细胞亚群，也识别出的新的免疫细胞亚群，鉴定出 HIV+ 患者的 PBMC 中显著上调基因。在这篇综述中，总结了 scRNA-seq 在动脉粥样硬化患者的斑块和 PBMC 中获得的最新数据。
【发表期刊】Cardiovascular Research（IF: 14.919）
【发布时间】2021年11月
【影响因子】10.787
【发表单位】美国加州拉霍亚免疫学研究所
1. 心血管疾病中的免疫细胞
心血管疾病仍然是世界范围内的主要死亡原因，仅次于癌症和 COVID-19。心血管疾病是一个广泛的术语，包括中风、心肌梗死（MI）或外周动脉疾病。这篇综述关注的是动脉粥样硬化，它是大多数心血管疾病的罪魁祸首。动脉粥样硬化是一种慢性炎症性动脉疾病，与血脂和低密度脂蛋白（LDL）胆固醇升高有关。虽然高胆固醇血症是疾病发生的必要条件，但免疫机制在病变的发展、进展和易感性中起着关键作用。【1】易损性是指病变有破裂或侵蚀的倾向，这与斑块帽厚度和免疫细胞含量有关。【2】
2017年，Canakinumab Antiinflammatory Thrombosis Outcome Study（CANTOS）首次证明，通过抑制炎症反应可以降低动脉粥样硬化心血管事件的风险。【3】在 CANTOS 中，一种靶向白介素 IL-1β 的单克隆抗体（canakinumab）被用于有 MI 病史和残留炎症风险的患者。接受 canakinumab 的患者经历动脉粥样硬化心血管事件的相对风险降低了15%，同时血液 hsCRP 和 IL-6 显著降低。重要的是，血脂，包括 LDL 胆固醇，不受抗 IL-1β 治疗的影响，强调了 canakinumab 的特异性抗炎作用。这项研究为寻找更有效、更有针对性和更安全的治疗动脉粥样硬化中残余炎症风险铺平了道路。
2. 动脉粥样硬化免疫细胞的异质性
对动脉粥样硬化病变中免疫细胞异质性的研究始于20世纪80年代的免疫染色，当时可以对两种标记物进行染色。组织中的免疫染色最近被细化到可以分辨大约16种标记物。流式细胞术于2006年被引入动脉粥样硬化的研究，标志物的范围得到扩展。随着技术发展，细胞质谱（CyTOF）可以检测大约40个标记。本文聚焦目前可用的最高分辨率的方法：单细胞转录组测序（scRNA-seq）、单细胞表面蛋白测序（多达200个抗体）、单细胞免疫组库。
3.人类动脉粥样硬化病变的单细胞转录组测序
以下汇总了动脉粥样硬化患者的斑块和/或 PBMC 中免疫细胞的 scRNA-seq 数据。【17-20】图1显示了动脉粥样硬化动脉中小鼠和人髓系细胞在同一 UMAP 中的整合。这三项研究【17, 18, 20】的主要目标是将 scRNA-seq 特征与心血管事件联系起来。一项研究【20】聚焦于发现白细胞亚群异质性及其转录组特征。三项研究集中在免疫细胞亚群，而 Wirka 等【18】主要涉及平滑肌细胞（SMC）表型。表1概述了这些研究的技术比较。近年来，从血管中分离免疫细胞的技术挑战包括酶消化、双细胞、死亡细胞、细胞应激、批次效应等。【26-30】 酶促的组织消化和机械的组织分解可能导致某些细胞类型的不均匀损失，这可能解释了在整个研究中观察到的可变性。T 细胞比体积大而脆弱的巨噬细胞或树突状细胞更能在分离过程中存活下来。酶消化过程中的细胞应激反应会影响研究结果。scRNA-seq 主要产生高表达基因，系统缺失低表达基因。由于消化程序、样本类型和样本收集方面的差异，以及实验差异，对这些研究进行直接比较具有挑战性。人动脉粥样硬化动脉主要免疫细胞亚群的关键标记基因如图2所示。
图1 动脉粥样硬化动脉中的人和小鼠髓系细胞
图2 人类动脉粥样硬化动脉主要免疫细胞亚群的关键标记基因
表1人类 scRNA-seq 研究的技术信息
人类斑块 scRNA-seq 的基础文章【17】分析了通过颈动脉内膜剥脱术获得的人类斑块和匹配的 PBMC 中的白细胞。颈动脉内膜剥脱术样本含有斑块、纤维帽，有时也有颈动脉中层的一部分，但没有外膜。用 10x Genomics 3’ scRNA-seq 联合表面抗体分析了来自同一患者的 PBMC（1654个细胞）和颈动脉内膜剥脱术样本（254个细胞）。另外4例无症状和2例有症状的颈动脉内膜剥脱术样本采用3’ scRNA-seq 进行分析。
作者在斑块和血液中发现了16个 T 细胞群（表2）。出乎意料的是，CD8+ T 细胞主要在斑块(46%)中富集。血液 T 细胞转录组主要富集静息 CD4+ T 细胞，表达抑制 T 细胞功能的基因（KLF2 和 TXNIP）。斑块 T 细胞表达的基因与 T 细胞活化（NFATC2，FYN，ZAP70）、细胞毒性（GZMA，GZMK）和 T 细胞衰竭（EOMES，PDCD1，LAG3）相关。斑块 CD4+ T 细胞处于激活的促炎状态。
表2人 scRNA-seq 检测的免疫细胞亚群
虽然表面抗体检测只在一个斑块样本中使用，但它识别出5个不同的巨噬细胞亚群。Cluster 1表达了参与巨噬细胞激活的基因（HLA-DRA 和 CD74）。Cluster 2高度炎症，表达的基因参与炎症反应（CYBA，LYZ，S100A9/8，AIF1），Toll 样受体结合（S100A9/8），氧化还原酶活性（CYBA）和金属蛋白酶抑制（IMP1）。cluster3 中上调的基因参与促炎症反（JUNB, NFKBIA），高表达 MALAT1。这些细胞群可能与小鼠动脉粥样硬化中发现的炎性巨噬细胞相关（图1）【16】。Cluster 5 表达的基因参与胆固醇摄取和代谢（APOC1, APOE）和脂质积累（PLIN2），类似于小鼠动脉粥样硬化中的 TREM2 泡沫细胞。【16】这些巨噬细胞显示出促炎信号减弱（IL-1, IFN），这与泡沫细胞的抗炎性质一致。共46个样本（29个来自无症状患者，17个来自有症状患者）进行了细胞质谱检测【13，14】，仅获得2个可区分的巨噬细胞亚群。在 CyTOF 中使用和挑选的标记的数量，尽管提供了信息，但比在 scRNA-seq 中要少，这导致了免疫细胞亚群的分辨率较低。Vallejo【20】等在32个样本上使用了40种寡核苷酸标记的抗体，从而将类似于 CyTOF 的精确细胞表面表型与转录组结合起来。
Wirka等【18】使用了从移植心脏分离的人冠状动脉细胞。与颈动脉内膜剥脱术样本不同，这些样本包括外膜细胞。这项研究主要集中在 SMCs 和成纤维细胞样细胞（fibromyocyte），但这里只回顾了发现的免疫细胞亚群（巨噬细胞、T 细胞、B 细胞和 NK 细胞）。作者使用了 10x Genomics 平台和 PE150 测序。过滤少于500个基因的细胞和少于5个细胞表达的基因。通过丢弃含有超过3500个基因的细胞，可以减少双细胞。线粒体基因含量在7.5%以上的细胞被认为是死细胞。作者鉴定了7个免疫细胞群：表达 RNASE1、C1QA、C1QC、C1QB 和 CD14 的巨噬细胞；表达 IL32、TRAC、IL7R、CCL5 和 CD3D 的 T 细胞；表达 CD79A、CD37、MS4A1、LTB、CD52 的 B 细胞；表达 IGHM、JCHAIN、IGLC3、IGHV3-73、MZB1 的 IgM 浆细胞；表达IGHG2、IGHGP、MZB1、DERL3 的 IgG 浆细胞；表达 NKG7、GNLY、PRF1、GZMB、CCL5 的 NK 细胞；表达 TPSAB1、CPA3、C1orf186、SLC18A2、MS4A2 的肥大细胞。
关于人类斑块 scRNA-seq 的第三篇文章发表于2020年12月。斑块来自于颈动脉内膜剥脱术，14名男性和4名女性。Depuydt 等【19】使用 CD3、CD68、CD34 和抗 SMC 抗体对三个匹配的样本进行免疫组化分析。在这四种抗体范围内，免疫荧光数据与 scRNA-seq 数据一致。CEL-Seq2 技术提供的转录组深度比 10× Genomic 技术要深得多，但成本高得多，捕获的细胞也少得多。作者着重研究了斑块中不同细胞类型的特异性基因或与冠状动脉疾病相关的基因。在确定的11个免疫细胞群中，5个是淋巴细胞群，5个是髓细胞群，1个无法确定。共使用7种不同的抗体（CD45-PECy7、CD3-BV421、CD4-PETR、CD28-BV650、Granzyme B-PE、TruStain Fcx 和 Fixable Viability Dye-eFluor 780）将细胞分选到孔中。
作者发现了 CD4+ T 细胞的五个亚群（图2）。两个亚群具有细胞毒性，其中一个亚群表达PRF1、GZMA 和 GZMK，但很少表达 CD28，这表明这些细胞可能是 CD4+ CD28null39，另一个亚群表达 GZMA、GZMK 和 CD28。CD4+ 初始 T 细胞的一个亚群表达 IL7R、LEF1 和 SELL。通过 FoxP3、IL2RA 和 CTLA4 鉴定出 CD4+ 调节性 T 细胞；CD4+ 中心记忆 T 细胞表达 LEF1、IL7R 和 SELL。CD8+ T细胞的三个亚群中，GZMK+ 效应记忆T细胞表达GZMK，GZMA 和 CD69；终末分化细胞毒性 CD8+ T 细胞亚群表达 GZMB，TBX21，NKG7，GNLY，ZNF683 和 CX3CR1，缺乏 CD69；CD8+ 中央记忆 T 细胞表达 LEF1，SELL，IL7R 和 LTB。
在最初的聚类中，Depuydt 等【19】发现了5个髓系细胞群：由 HDC、KIT、CMA1、TPSAB1 鉴定的肥大细胞群和4个表达 CD14 和 CD68 的细胞群。这四个群进一步细分，获得五种不同的巨噬细胞。2个炎性巨噬细胞亚群分别表达 IL1B、CASP1、CASP4、KLF4 和 KLF4、IL1B、TLR4、ABCA1、TNF、IL18、CD9，分别命名为 IL1B+ 和 TNF+ 炎性巨噬细胞。ABCG1+泡沫巨噬细胞表达 ABCA1、ABCG1、MMP9、OLR1、TREM2、CD9、ACTA2、LGALS3、CD68、IL18 和 CD9。CD1c+ 树突状细胞亚群表达 CD1c、CLEC10A 和 FCER1A。
与 Fernandez【17】和 Winkels【14】等人的研究一样，T 细胞占分析细胞的大多数（52%），而髓系细胞仅占19%。对 Winkels 小鼠数据【14】和其他8个小鼠数据【16】的荟萃分析表明，T细胞的富集是由于髓系细胞的缺失，很可能是由样品消化过程引起的。巨噬细胞不如圆形淋巴细胞耐消化处理，因此，Fernandez【17】和 Depuydt【19】等人发现的髓系细胞的比例低，巨噬细胞会优先缺失。此外，颈动脉内膜剥脱术样本缺乏大部分中膜和所有外膜，而这些正是巨噬细胞存在的地方。
最近的关于动脉粥样硬化的 scRNA-seq 研究【20】是对31名女性受试者的 PBMC 样本进行的，其中16人有亚临床动脉粥样硬化，由颈动脉超声确定。在31名被研究的女性中，有24人携带艾滋病毒，大多数人的病毒载量无法检测到。该研究使用 BD Rhapsody 检测485个基因和40个抗体。总共获得了32000个细胞，鉴定出58个不同的亚群，包含CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、B 细胞、NK 细胞和单核细胞。为了检测心血管疾病的变化，他们分析了患有和不患有心血管疾病的受试者之间的基因变化。所有这些受试者都是 HIV 阳性。
在 CD4+ 效应记忆 T 细胞中，CVD 组 IL-32 显著升高。IL-32 是一种炎症细胞因子，已知在心血管疾病中起重要作用。在 CD4+ 初始 T 细胞中，IL-32、SELL、SELPLG 和 CCR7 在 CVD 组中也显著增加。其中一个 CD4+ 效应记忆 T 细胞显示 TRAIL 的显著上调。在 CD8+终末分化记忆T细胞，IL32 在 CVD 女性患者中较高，在 CD8+ 初始 T 细胞群中也是如此。在一个 EMRA CD8+ T 细胞群中，CD52、TRAC 和 HOPX 在 CVD 组显著上调，一些杀伤细胞凝集素受体（KLRC4、KLRD1、KLRG1 和 KLRK1）也在 CVD 组上调。趋化因子 CCL5 及其主要受体 CCR5 参与动脉粥样硬化、心肌梗死的发展。CCL5 编码趋化因子 RANTES，已知在动脉粥样硬化中起重要作用。CCL5 或其受体在动物模型中有助于减少新内膜形成，巨噬细胞浸润以及动脉粥样硬化斑块的形成。在一些研究中，CCL5 也被用作可能的 CVD 生物标志物。最后，在 CD8+ 效应记忆 T 细胞中，CVD 与 IL32、TRAC、HOPX、CCL5 和杀伤凝集素受体 KLRK1、KLRC4、KLRD1 显著升高相关。
在一个典型单核细胞群中，CVD 与 CCL4、SLC2A3、SOD2 和 SELPLG 显著增加相关。在另一个经典单核细胞群中，TNF、DUSP1、TRAIL、APRIL 和 BAFF 与 CVD 高度相关。CCL3、CCL4、IL1B、TLR2 和 DUSP2，已知与动脉粥样硬化相关，在CVD组的第三个经典单核细胞群高度上调。
4.总结
在没有表面标记物的情况下，使用 scRNA-seq 转录组来区分 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞仍然具有挑战性。细胞表面表型信息的添加大大提高了免疫细胞的识别， Fernandez 等人【17】（21个寡核苷酸标记抗体）和 Vallejo 等人【20】（40个寡核苷酸标记抗体）阐述了这项技术的力量。现在，多达 200 种抗体可用于人类和小鼠细胞，与 scRNA-seq 结合，将提高免疫细胞亚群的分辨率，并增加发现新细胞亚群的机会。为了研究动脉粥样硬化特征基因，必须包含健康对照，这在基于内膜切除术的研究中是不可能的，但可以使用 PBMC 和移植心脏的非动脉粥样硬化冠状动脉。scRNA-seq 结合细胞表面表型将提高人类动脉粥样硬化免疫细胞图谱的分辨率和质量。
参考文献
1. Wolf D, Ley K. Immunity and inflammation in atherosclerosis. Herz 2019;44: 107–120.
2. Mori H, Torii S, Kutyna M, Sakamoto A, Finn AV, Virmani R. Coronary artery calcification and its progression: what does it really mean? JACC Cardiovasc Imaging 2018;11: 127–142.
3. Ridker PM, Everett BM, Thuren T, MacFadyen JG, Chang WH, Ballantyne C, Fonseca F, Nicolau J, Koenig W, Anker SD, Kastelein JJP, Cornel JH, Pais P, Pella D, Genest J, Cifkova R, Lorenzatti A, Forster T, Kobalava Z, Vida-Simiti L, Flather M, Shimokawa H, Ogawa H, Dellborg M, Rossi PRF, Troquay RPT, Libby P, Glynn RJ; CANTOS Trial Group. Antiinflammatory therapy with canakinumab for atherosclerotic disease. N Engl J Med 2017;377:1119–1131.
4. Saigusa R, Winkels H, Ley K. T cell subsets and functions in atherosclerosis. Nat Rev Cardiol 2020;17:387–401.
5. Ali AJ, Makings J, Ley K. Regulatory Tcell stability and plasticity in atherosclerosis. Cells MDPI 2020;9:2665.
6. Kuijk K. V, Kuppe C, Betsholtz C,Vanlandewijck M, Kramann R, Sluimer JC. Heterogeneity and plasticity in healthy and atherosclerotic vasculature explored by single-cell sequencing. Cardiovasc Res 2019;115:1705–1715.
7. Winkels H, Wolf D. Heterogeneity of T cells in atherosclerosis defined by single-cell RNA-sequencing and cytometry by time of flight. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2021;41:549–563.
8. Tabas I, Lichtman AH. Monocyte-macrophages and T cells in atherosclerosis. Immunity 2017; 47:621–634.
9. Kobiyama K, Ley K. Atherosclerosis. Circ Res 2018;123:1118–1120.
10. Hansson E. Primary astroglial cultures. A biochemical and functional evaluation. Neurochem Res 1986;11:759–767.
11. Tang J, van Panhuys N, Kastenmu¨ller W, Germain RN. The future of immunoimaging–deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful. Eur J Immunol 2013; 43:1407–1412.
12. Galkina E, Kadl A, Sanders J, Varughese D, Sarembock IJ, Ley K. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. J Exp Med 2006;203: 1273–1282.
13. Cole JE, Park I, Ahern DJ, Kassiteridi C, Danso Abeam D, Goddard ME, Green P, Maffia P, Monaco C. Immune cell census in murine atherosclerosis: cytometry by time of flight illuminates vascular myeloid cell diversity. Cardiovasc Res 2018;114:1360–1371.
14. Winkels H, Ehinger E, Vassallo M, Buscher K, Dinh H, Kobiyama K, Hamers A, Cochain C, Vafadarnejad E, Saliba A-E, Zernecke A, Pramod A, Ghosh A, Anto Michel N, Hoppe N, Hilgendorf I, Zirlik A, Hedrick C, Ley K, Wolf D. Atlas of the immune cell repertoire in mouse atherosclerosis defined by single-cell RNA-sequencing and mass cytometry. Circ Res 2018;122:1675–1688.
15. Hill CA, Fernandez DM, Giannarelli C. Single cell analyses to understand the immune continuum in atherosclerosis. Atherosclerosis 2021;330:85–94.
16. Zernecke A, Winkels H, Cochain C, Williams JW, Wolf D, Soehnlein O, Robbins CS, Monaco C, Park I, McNamara CA,Binder CJ, Cybulsky MI, Scipione CA, Hedrick CC, Galkina EV, Kyaw T, Ghosheh Y, Dinh HQ, Ley K. Meta-analysis of leukocyte diversity in atherosclerotic mouseaortas. Circ Res 2020;127:402–426.
17. Fernandez DM, Rahman AH, Fernandez NF, Chudnovskiy A, Amir ED, Amadori L, Khan NS, Wong CK, Shamailova R, Hill CA, Wang Z, Remark R, Li JR, Pina C, Faries C, Awad AJ, Moss N, Bjorkegren JLM, Kim-Schulze S, Gnjatic S, Ma A, Mocco J, Faries P, Merad M, Giannarelli C. Single-cell immune landscape of human atherosclerotic plaques. Nat Med 2019;25:1576–1588.
18. Wirka RC, Wagh D, Paik DT, Pjanic M, Nguyen T, Miller CL, Kundu R, Nagao M, Coller J, Koyano TK, Fong R, Woo YJ, LiuB, Montgomery SB, Wu JC, Zhu K, Chang R, Alamprese M, Tallquist MD, Kim JB, Quertermous T. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nat Med 2019;25:1280–1289.
19. Depuydt MAC, Prange KHM, Slenders L, O¨rd T, Elbersen D, Boltjes A, de Jager SCA, Asselbergs FW, de Borst GJ, Aavik E, Lo¨nnberg T, Lutgens E, Glass CK, den Ruijter HM, Kaikkonen MU, Bot I, Slu¨tterB, van der Laan SW, Yla-Herttuala S, Mokry M, Kuiper J, de Winther MPJ, Pasterkamp G. Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics. Circ Res 2020;127:1437–1455.
20. Vallejo J, Saigusa R, Gulati R, GhoshehY, Durant CP, Roy P, Ehinger E, Pattarabanjird T, Padgett LE, Olingy CE, Hanna DB, Landay AL, Tracy RP, Lazar JM, Mack WJ, Weber KM, Adimora AA, Hodis HN, Tien PC, Ofotokun I, Heath SL, Dinh HQ, Shemesh A, McNamara CA, Lanier LL, Hedrick CC, Kaplan RC, Ley K. Combined protein and transcript single cell RNA sequencing in human peripheral blood mononuclear cells. bioRxiv 2020.09.10.292086; doi:10.1101/2020.09.10.292086.
