真·高通量单细胞全长转录组

2020-11-13 本文已影响0人 ee00dc6faab7

单细胞转录组测序

单细胞转录组目前主要有三种建库测序方案（图1）：

1. 以10x Genomics 为代表的3‘/5’ 转录组测序：本方案对转录本一端进行测序，可以满足一般的转录组定量分析需求，细胞通量高，测序成本相对较低，缺点是一般只能检测到转录本3‘/5’端600nt以内的信息，其他信息丢失了；

2. Smart-seq：本方案将cDNA打断后，对转录本的所有片段测序，优势是测序灵敏度高（基因检出数比3‘/5’ 转录组测序高）、可以检测转录本的全长片段信息，缺点是细胞通量较低，单个细胞的测序成本较高，而且检测的并不是真实的全长转录本；

3. 单细胞三代转录组测序：在获得单细胞全长cDNA后经过扩增和建库，用Nanopore平台或者Pacbio平台测序。由于cDNA不会被打断，避免了短reads的拼接过程带来的错误，因此检测的是真实的转录本全长信息，缺点是目前测序通量太低，测序错误率较高，单价过高。

图1 单细胞转录组测序方法reads分布示意图

单细胞三代全长转录组测序技术

目前主要有基于两个三代测序平台的三种单细胞三代全长转录组测序技术：

(本文主要介绍高通量单细胞全长转录组测序技术，低通量的暂未介绍)

1. scISOr-seq (10x Genomics + Pacbio ISO-seq)

图2 Pacbio平台Single cell ISO-seq

技术方案：1）单细胞解离后，利用10x 3’ RNA kit完成细胞分选和逆转录，得到全长的cDNA; 2) 部分全长cDNA用于常规二代测序；3）部分全长cDNA经过PCR扩增后构建Pacbio SMRT文库，并进行测序；4）二代、三代数据结合分析（主要是cell barcode拆分和UMI矫正）。

2. ScNaUmi-seq (10x Genomics + ONT)

图3 ONT平台ScNaUmi-seq

技术方案：1）单细胞解离后，利用10x 3’ RNA kit完成细胞分选和逆转录，得到全长的cDNA; 2) 部分全长cDNA用于常规二代测序；3）部分全长cDNA经过PCR扩增后构建nanopore文库，并进行测序；4）二代、三代数据结合分析（主要是cell barcode拆分和UMI矫正）

ScNaUmi-seq与scISOr-seq虽然技术平台不同，但是原理上比较相似。

3. R2C2 (10x Genomics + ONT)

图4 ONT平台R2C2

技术方案：1）单细胞解离后，利用10x 3’ RNA kit完成细胞分选和逆转录，得到全长的cDNA; 2) 部分全长cDNA用于常规二代测序；3）部分全长cDNA经过RCA扩增后构建nanopore文库，并进行测序；4）可仅利用三代数据进行下游分析。

R2C2方法特殊之处在于全长cDNA的环化扩增（RCA），将较短的转录组cDNA (平均长度1.2~1.5k)经滚换复制后生成长链DNA（平均长度3~5k），在对其测序时，相当于将同一来源的cDNA分子重复检测了3~5遍，以此提高测序的准确度。

三种技术方案数据对比：

当对比不同技术不同平台时，要尽量避免样本来源不同、细胞数目差异、测序深度不同和统计方式的差异。单细胞全长转录组目前面临的最大难题之一在于成本过高，因此，提升测序通量，提升reads有效利用率是当下面临的关键难题。

诺禾致源单细胞全长转录组测序产品

诺禾致源与ONT公司共同研发了基于10x Genomics 平台和ONT 平台的三代单细胞全长转录组测序产品。我们从10x Genomics上机捕获，到cDNA纯化、扩增以及后续的建库环节都进行了研发和优化，并且搭建了相应的生物信息分析流程。

图5 诺禾致源单细胞全长转录组测序方案

本产品实验需要从单细胞捕获开始（由于单细胞捕获步骤有改变，因此不能使用客户目前已经获得的单细胞样本cDNA），同时进行illumina二代测序和ONT 建库测序。二代+三代数据整合分析，从而实现在单细胞水平上检测可变剪切、isoform差异分析、基因融合和SNV等分析。

单细胞三代全长转录组产品对细胞上机的要求与普通二代单细胞转录组一致，不过我们建议初次目标捕获细胞数在5000以内，之后可按情况进行调整。

我们以人源PBMC样本进行了测试，优化前和优化后两个样本的细胞来源于同一管细胞，目标捕获细胞数都是5000，建库后分别用一个ONT PromethION flow cell 测序。

经诺禾致源研发优化后，每个细胞的基因检出中位数和UMI检出中位数都提升了2倍以上。

图6 优化后样本基因检出数与UMI数大大提升

图7 优化后样本细胞分群结果较优化前显著提升

图8 Illumina与nanopore数据B cell 相关marker gene 表达情况

诺禾致源单细胞全长转录组产品将测序通量和单位产出提升了2倍以上，可大幅降低测序成本。若您对单细胞全长转录组产品感兴趣，请联系当地销售或者技术支持。

下期我们将推出单细胞全长V(D)J三代测序产品，敬请期待！

参考文献：

[1] Gupta, I., Collier, P., Haase, B. et al. Single-cell isoform RNA sequencing characterizes isoforms in thousands of cerebellar cells. Nat Biotechnol 36, 1197–1202 (2018). https://doi.org/10.1038/nbt.4259

[2] Laura Mincarelli, Vladimir Uzun, Stuart A. Rushworth, Wilfried Haerty, Iain C. Macaulay.Combined single-cell gene and isoform expression analysis in haematopoietic stem and progenitor cells.bioRxiv 2020.04.06.027474;

doi: https://doi.org/10.1101/2020.04.06.027474

[3] Roger Volden, Christopher Vollmers. Highly Multiplexed Single-Cell Full-Length cDNA Sequencing of human immune cells with 10X Genomics and R2C2. bioRxiv 2020.01.10.902361; doi: https://doi.org/10.1101/2020.01.10.902361

[4] Lebrigand, K., Magnone, V., Barbry, P. et al. High throughput error corrected Nanopore single cell transcriptome sequencing. Nat Commun 11, 4025 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-17800-6