单细胞108篇文献解读之16--Cross-Species Si
跨物种单细胞测序发现了一类具有抗原提呈作用的肿瘤相关成纤维细胞（apCAF）。
该文章在2019年发表于Cancer discovery，影响因子29.497，作者为冷泉港实验室肿瘤中心主任David Tuveson教授。
该课题组建立了大量人类肿瘤类器官和3D培养模型来探索癌症发生发展的内在机制，如研究胰腺癌氧化还原稳态，癌基因Ras的信号传导过程，旨在发现胰腺癌的早期诊断标志物，并确定胰腺癌细胞和肿瘤基质细胞之间的交互作用机制。
在肿瘤高分领域单细胞测序满天飞的当下，作者发现了新的CAF亚群并通过功能验证成功蹭到肿瘤免疫的热点，为靶向药物研发以及个体化治疗提供了新的思路。
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研究背景
胰腺导管腺癌（PDAC）病死率高、预后较差，对常规治疗应答不良，其特征在于以CAF为代表的大量非恶性基质细胞。早期人们发现了tumor-promoting CAF，而敲除小鼠体内的CAFs则促进肿瘤转移。
作者前期发现了炎症性iCAF和肌纤维母细胞的myCAF，为了进一步研究PDAC的异质性，课题组通过单细胞转录组测序发现了一类表达MHC class II和CD74的新CAF亚群，并将其命名为apCAF（antigen-presenting CAFs）。
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思路模块
正文共7组图，可分为三个部分。第一部分为人源PDAC基质细胞和CAFs亚群描述（Fig.13）。第二部分是在小鼠和人源组织中发现apCAF并进行鉴定（Fig.46）。第三部分是通过小鼠模型进行新亚群apCAF的功能验证（Fig.7）。
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数据解读
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课题组收集了6例PDAC组织和2例癌旁对照，共计21,200个细胞。通过流式分选了CAFs和非CAFs的细胞群（图1A），然后进行t-SNE降维处理得到15个细胞群，发现基质细胞以髓样和淋巴样为主（图1B），进一步展示了每类细胞对应的特异标志物(平均5246个转录本，1576个基因；图1C)。
在人源PDAC组织中鉴定出四群胰管细胞, 其中第2群来源于正常组织,其它3群主要来源于肿瘤组织（图1DE）。图1F展示了每群胰管细胞对应的特异标志物。通路分析(1,3,4群vs2群) 富集到KRAS，p53和hypoxia pathway，符合肿瘤特征。
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Fig.2 免疫抑制微环境在人源PDAC中具有重要作用
在髓样细胞中进行降维处理后发现了一些以单核巨噬为主的细胞群（图2A），其中第4群（替代性活化的巨噬细胞）全部来源于肿瘤组织，且高表达免疫抑制因子，如SPP1, LY6E, MARCO（图2BC）。进一步发现单核巨噬细胞表达粒细胞标志物，提示髓样细胞具有高度异质性（图2D）。
在T 和NK细胞中通过降维处理发现5个细胞群，以T细胞为主，其中第3群（Treg）全部来源于肿瘤组织 且高表达以CTLA4和TIGIT为代表的免疫抑制因子，此外检测到T/NK细胞耗竭标志物，提示参与免疫抑制（图2E~H）。
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Fig.3 在人源PDAC组织中检测到不同的CAFs亚群（前期工作验证）。
作者分析了962个CAFs的相关标志物通过降维处理后发现了两个细胞亚群即iCAFs和myCAFs（图3AB）。
Pan-CAF特异性表达COL1A1，FAP，PDPN，DCN和VIM（图3C）；iCAFs高表达炎症和趋化因子如CXCLs, CCLs；myCAFs高表达aSMA(ACTA2)等标志物（图3DE）。
进一步分析CAFs内异常激活的分子发现iCAFs的差异表达分子如IL1R1和STAT3，myCAFs的差异表达分子如TGFBI和SMAD2 (图3F~I) 。
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Fig.4 在KPC小鼠PDAC组织中发现新的CAFs亚群（apCAF）。
作者构建了4只KPC小鼠并获取了11,260个细胞，t-SNE降维处理后得到12个细胞群，其基质细胞以巨噬和中性粒为主（图4A）。
图B展示了每类细胞对应的特异标志物(平均5989个转录本，1916个基因)。在4012个CAFs中发现三个亚群即iCAF，apCAF和myCAF，其中apCAF异常激活的分子H2-Ab1和Cd74编码MHC-II（图4C~H）。
表1 CAF细胞亚群特异标志物
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Fig.5 在KPC小鼠组织中鉴定出新的CAFs亚群（apCAF）
在图5A~D中作者通过RNA原位杂交检测到Col1a1(pan-CAF marker)和H2−Ab1 (apCAF)，IHC检测到PDPN(pan-CAF marker)和CD74(apCAF)，流式分选到三个CAF亚群（iCAF，apCAF和myCAF）。
其中apCAF高表达H2−Ab1，Cd74， Slpi ，Saa3（图5E），iCAF高表达Cxcl12，Pi16，Il6（图5F）；myCAF高表达Acta2，Tgfb1，验证了前期测序结果（图5G）。
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Fig.6 在人源PDAC组织中鉴定出新的CAFs亚群（apCAF）
作者检测了人源CAFs表达编码MHCII的基因HLA-DRA，HLA-DPA1和HLA-DQA1，pan-CAF marker Col1a1，mouse apCAF marker CD74、SLPi，结果发现20.9% human CAFs同时表达CD74和HLA-DRA（图A~C）。
在图D中通过Imaging mass cytometry检测到人源PDAC组织中的pan-CAF marker Col1a1（绿色） ，apCAF marker CD74和HLA-DR（白色）；同时不表达CD45（红色）或EPCAM（紫色）。
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Fig.7 apCAF提呈抗原激活CD4+T
对KPC小鼠2-D培养后，发现其apCAF丢失MHCII相关markers，而获得myCAF markers，提示CAFs发生了亚群转化（图7A）。
在T细胞激活实验中作者制备了原位类器官KPC小鼠模型用于分选CAFs和APCs，另制备OVA特异性激活的TCR小鼠模型，分选CD4+T并进行共培养，流式检测细胞共培养结果（图7BC）。
APCs+OVA组能够诱导产生更多的CD69+T cell，apCAF+OVA组类似，但效果低于前者，但myCAF或iCAF无法激活T细胞（图7D）。apCAF、myCAF和iCAF均不表达协同刺激分子，提示与传统APC激活T的机制略有差别（图7E）。
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文章小结
跨物种单细胞测序发现了具有抗原提呈作用的肿瘤相关成纤维细胞，其主要技术路线包括临床样本→单细胞RNAseq→数据建库→表达矩阵→降维策略→类的注释→下游分析。
作者主要发现了新的亚群apCAF及其标志物；apCAF具有抗原提呈功能；CAFs亚群之间的演化。对于apCAF介导肿瘤免疫的内在机制以及靶向CAFs亚群的个体化治疗方案仍然是未知的探索方向。
近年来仅靠单细胞测序发表高水平文章的数量逐年减少，科学家们逐渐将测序工作与后续的功能验证相结合。如能提供空间转录组信息分析细胞亚群之间的定位结果则会为相关功能的研究奠定更为扎实的科学基础。
单细胞测序发上30分的靠谱路线_apCAF
