MultiQC使用
一、MultiQC的安装
1.先安装conda
我们先前安装过，但是发现不能用了，在网上查询后，发现问题，下面是解决方法
<参考https://www.jianshu.com/p/edaa744ea47d>
- 下载conda时选择是否自动添加环境变量时，这里选择no,因为自动添加会干扰系统，致使conda不能用，然后输入以下命令运行conda
cd anaconda3/bin
chmod 777 activate #给activate添加一下权限才能使用conda
source ./activate #启动conda
-
当命令行前面出现(base)的时候说明现在已经在conda的环境中了
image.png
- 注意用conda安装的软件必须在conda环境下
- 之后的配置Python环境和配置conda channels步骤和老师ppt里讲的一致
2.安装MultiQC
- 输入以下命令
conda install -c bioconda multiqc
-c这个参数很重要，通过它来指定软件下载的镜像位置
- 使用以下命令查看是否安装成功
multiqc --version
或者
multiqc -h
image.png
image.png
二、下载sra序列
1、下载数据
-
在NCBI数据库里面的SRA数据库里随意找了两个SRR数据下载下来
-
为防止太大，找了几个小一点的，如图所示
1.PNG
image.png
-
使用下列命令下载下来
prefetch SRR8073294
prefetch SRR8073207
image.png
显示成功下载，下载后的内容放在~/ncbi/public/sra路径下
2、解压SRA文件为fastq格式
有两种方法解压
- 一个一个解压
fastq-dump --gzip --split-files SRR8073294.sra
fastq-dump --gzip --split-files SRR8073207.sra
- 批量下载
我建议就单独解压，因为该文件下不止我们现在需要用的两个SRR，用prefetch下载的都在这里，除非在该路径下mkdir一个文件夹存放这两个数据
(1).新建脚本文件
vi fqdump.sh
(2).输入以下脚本
#!/bin/sh
for i in *sra
do
echo $i
fastq-dump --gzip --split-files $i
done
保存退出
这里--gzip参数是为了生成压缩的gz格式fastq文件，以节省磁盘空间
(3)运行脚本
sh fqdump.sh
-
成功转换成以fastq.gz结尾的四个文件，因为是双端测序，每个样本有正向和反向两个文件
image.png
三、用fastqc进行数据质量评价
fastqc SRR8073207_1.fastq.gz
fastqc SRR8073207_2.fastq.gz
fastqc SRR8073294_1.fastq.gz
fastqc SRR8073294_2.fastq.gz
image.png
四、使用multiqc整合
<以下有些内容有所参考https://www.jianshu.com/p/85da4dcc6020里的内容>
- 输入以下命令
multiqc .
-
结果如下
image.png
-
生成了两个文件，1个html报告和1个multiqc_data的文件夹，前者直接网页打开就可以查看，后者包含一些数据基本的统计信息和日志文档
image.png
- 可以把multiqc_report.html 下载下来到本地，用windows的浏览器打开，也可以直接在图形界面打开查看
五、结果分析
1. General Statistics：所有样本数据基本情况统计
image.png
这里可以看到重复reads的比例、GC含量占总碱基的比例、测序长度、总测序量
2.Sequence Counts：序列计数
image.png
这里可以看到重复reads，我找的这四个序列重复reads比例都偏高,尤其是SRR8073207达到了90%以上，说明这两个样本的序列中有用的reads数目较少
3.Sequence Quality Histograms ：每个read各位置碱基的平均测序质量
image.png
绿色区间——质量很好，橙色区间——质量合理，红色区间——质量不好
可以看出SRR8073207测序质量比SRR8073294的好，SRR8073294_2这个有点问题
4.Per Sequence Quality Scores 具有平均质量分数的reads的数量
image.png
绿色区间——质量很好、橙色区间——质量合理、红色区间——质量不好
可以看出这四个序列的整体测序质量还是很不错，所有的都在绿色区域
5.Per Base Sequence Content ：每个read各位置碱基ATCG的比列
image.png
结果显示四个序列都报错，说明每个位置每种碱基出现的概率差别很大，可能有过表达序列的污染
6.Per Sequence GC Content ：reads的平均GC含量
image.png
这里结果显示四条序列都被报错，从形状上来看曲线和正态曲线相差甚远，可能是由于文库的污染或是部分reads构成的子集有偏差造成的
7.Per Base N Content ：每条reads各位置N碱基含量比例
image.png
说明测序仪器能辨别这四个序列中每条reads的每个位置的碱基
8.Sequence Length Distribution 序列长度分布
image.png
对于这四个序列，每次测序仪测出来的长度主要都在251bp
9.Sequence Duplication Levels：每个序列的相对重复水平
image.png
四个序列中的重复的reads的程度都超过了范围，unique reads比例太少
10.Overrepresented sequences：文库中过表达序列的比例
image.png
这四个序列中过表达的序列的比例都远远超过1%,SRR8073294的两个序列中过表达的序列都超过50%，如果出现这种情况，不是这种转录本巨量表达，就是样品被污染
11.Adapter Content 接头含量
image.png
SRR8073294的两个序列接头含量比SRR8073207多，但两者接头含量都超过了5%，而且SRR8073294_1的接头含量接近10%
- 总的来说这两个样本测序质量还行，但是重复序列太多了，没有多少有用的序列，GC含量不正常，很有可能样品存在被污染的情况。
