Day 7 - Sequencing knowledge

LunaprimRose 2020.03.19

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Process & Principle

第一代测序技术

1977年 Sanger 等发明双脱氧核苷酸末端终止法和 Gilbert 等发明的化学降解法

• 由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应
• 在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（ddATP , ddCTP , ddGTP , ddTTP），
• 通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列

第二代测序技术

边合成边测序 sequencing by Synthesis,SBS

在 Sanger 等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的 dNTP ，当 DNA 聚合酶合成互补链时，每添加一种 dNTP 就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测 DNA 的序列信息

• DNA 文库构建

将基因组DNA 随机片段化，然后通过末端修复、磷酸化、加 A 等步骤修补成平末端，最后加上特定的接头 Adaptor，构建成 DNA 文库

• Flowcell

Flowcell 是用于吸附流动 DNA 片段的槽道，当文库建好后，这些文库中的 DNA 在通过 Flowcell 的时候会随机附着在 flowcell 表面的 channel 上。每个 Flowcell 有8个 channel ，每个 channel 的表面都附有很多接头，这些接头能和建库过程中加在 DNA 片段两端的接头相互配对（这就是为什么 Flowcell 能吸附建库后的 DNA 的原因），并能支持 DNA 在其表面进行桥式 PCR 的扩增

• 桥式 PCR 扩增与变性

桥式 PCR 以 Flowcell 表面所固定的接头为模板，进行桥形扩增。经过不断的扩增和变性循环，最终每个 DNA 片段都将在各自的位置上集中成束，每一个束都含有单个 DNA 模板的很多分拷贝，进行这一过程的目的在于实现将碱基的信号强度放大，以达到测序所需的信号要求

• 测序

测序方法采用边合成边测序的方法。向反应体系中同时添加 DNA 聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种 dNTP（如同 Sanger 测序法）。这些 dNTP 的 3’-OH 被化学方法所保护，因而每次只能添加一个 dNTP 。在 dNTP 被添加到合成链上后，所有未使用的游离 dNTP 和 DNA 聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除 dNTP 3’-OH 保护基团，以便能进行下一轮的测序反应

第三代测序技术

单分子实时 DNA 测序

DNA 测序时，不需要经过 PCR 扩增，实现了对每一条 DNA 分子的单独测序，凭借超长的读长和可直接检测表观修饰

• SMRT 技术

采用边合成边测序方法，以 SMRT 芯片为测序载体，芯片上众多小孔中的DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记4种碱基（dATP , dCTP , dGTP , dTTP)，在碱基配对阶段，加入不同碱基会发出不同的光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。另外，若碱基存在修饰，则通过聚合酶的速度会减慢，因此可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间、两峰之间的距离来检测甲基化等碱基修饰情况。SMRT 测序速度快（每秒约数个 dNTP ），但是，测序错误率也较高（达到15%，可通过多次测序进行有效的纠错）

• 纳米孔单分子测序技术

驱动 DNA 分子通过纳米孔，导致电荷发生变化，每种碱基引起的电流变化是不同的，通过检测这些电流进而转化为对应的碱基序列

Noun interpretation

基因组学 核酸序列分析

• 全基因组测序 WGS
• 全外显子测序 WES
• 简化基因组测序 RRGS
  • RAD-Seq
  • GBS
  • 2bRAD
  • ddGBS ddRAD
• 作用
  • 基因组作图 遗传图谱、物理图谱、转录本图谱
  • 核苷酸序列分析
  • 基因定位
  • 基因功能分析
• 以全基因组测序为目标的结构基因组学
• 以基因功能鉴定为目标的功能基因组学

转录组学 基因表达分析

• mRNA-Seq
• lncRNA-Seq 长链非编码 RNA
• sRNA-Seq 主要是 miRNA-Seq
• 作用
  • 获得物种或者组织的转录本信息
  • 得到转录本上基因的相关信息，如基因结构功能等
  • 发现新的基因
  • 基因结构优化
  • 发现可变剪切
  • 发现基因融合
  • 基因表达差异分析

蛋白质组学

• 蛋白质组数据处理、蛋白及其修饰鉴定
• 构建蛋白质数据库、相关软件的开发和应用
• 蛋白质结构功能预测
• 蛋白质连锁图

代谢组学

• 代谢物指纹分析
• 代谢轮廓分析