[文献分享]稻瘟病中的几丁质酶参与水稻免疫

这次分享的是一篇中规中矩的文章，并没有太多出彩的地方，但是逻辑性较好，对于试验方法的应用具有较强的借鉴意义。福建农林的老师于2019年发表在plant physiology上的paperA Magnaporthe Chitinase Interacts with a Rice
Jacalin-Related Lectin to Promote Host Colonization

Abstract

水稻稻瘟病的基因组编码15个糖苷水解酶，18个家族的几丁质水解酶。本文主要讲了稻瘟病中的chitinase MoChi1和水稻中的膜蛋白 OsMBL1互作，从而在植物PTI过程中发挥作用。在稻瘟病中敲除MoChi1还会导致菌丝减少和毒性减少，因为导致了植物防卫相关基因的表达。OsMBL1正调抗病性，MoChi1抑制了几丁质介导的活性氧爆发，并且与OsMBL1竞争性结合几丁质。

Results

1.MoChi1 Is a Highly Conserved Chitinase from M. oryzae

MoChi1包含N端信号肽和GH18(Glycoside hydrolase)结构域，并且与其他致病真菌的糖苷水解酶同源性很高，暗示其可能有几丁质酶的活性。

2.MoChi1 Is an Extracellular Chitinase Released by
M. oryzae

构建MoChi1连GFP的载体，做融合蛋白，转入稻瘟病菌中，从上清中收集到了蛋白，说明MoChi1是个胞外蛋白。接下来使用yeast trap secretion assay 证明其分泌特征，与蔗糖酶(SUC2)构建融合蛋白，一个是全长(FL-MoChi1)，一个去掉去掉信号肽但在蛋白前段加上‘ATG’(NS-MoChi1)。如果蔗糖酶分泌的话，就会把蔗糖水解成葡萄糖和果糖。结果显示，转FL-MoChi1的酵母在蔗糖培养基上生长且培养基变红，而NS-MoChi1在蔗糖培养基中不生长，说明MoChi1中信号肽对其分泌很重要。

使用几丁质结合和几丁质分解活性的试验来检测MoChi1是否有几丁质酶活性。在几丁质结合试验中，将纯化的SSB-MoChi1-6*His蛋白与不溶性的细胞壁多糖孵育，结果显示，融合蛋白特异性地与不溶性的几丁质beads、crab shell chitin、chitosan、稻瘟病的细胞壁和几丁质共沉淀，而不与纤维素共沉淀。这些结果揭示MoChi1特异性结合几丁质。

MUC3是几丁质酶的一种商业化的荧光底物，使用它来查看几丁质酶的活性。

综上，这些结果显示，MoChi1是一种由稻瘟病分泌的几丁质酶，能将MUC3降解成短链。

3.MoChi1 Is Involved in M. oryzae Aerial Growth

首先检查MoChi1在稻瘟病不同时期的亚细胞定位，发现大部分MoChi1在营养菌丝隔膜上积累。以菌落直径作为衡量标准时，在稻瘟病中敲除MoChi1并不会造成营养生长的缺陷。

4.MoChi1 Is Required for the Aggressiveness of M. oryzae

为了确定MoChi1是否促进了稻瘟病的致病性，将Ku80(WT)、ΔMochi1(KO), and ΔMochi1/MoChi1(complement)接种于感病植株(CO39)，结果发现ΔMochi1菌的数量和大小比WT和互补菌中更少。通过对稻瘟病转座因子基因Pot2的定量PCR检测，发现ΔMochi1的生物量比野生型Ku80和互补菌株ΔMochi1/MoChi1减少了4- 5倍的生物量。

5.MoChi1 Interacts with the Rice JRL OsMBL1

酵母晒库筛到OsMBL1，通过Y2H，Co-IP，BiFC(揭示其互作可能发生在膜上)，PULL DOWN验证了其互作。缺乏N端19个氨基酸的OsMBL1仍能与MoChi1互作；而缺乏C端66个氨基酸的OsMBL1不能与MoChi1互作，N端和C端同时切掉后，也没有互作，这就揭示了OsMBL1的C端对于其与MoChi1的互作很重要。

6.OsMBL1 Is Responsive to PAMPs and M. oryzae Infection

chitin处理2h后，OsMBL1的表达量上升了大约六倍；flg22处理后，在30min到2h之间，表达量上升2-5倍不等。而接种稻瘟病后，在24h后大约上升了15倍。

7.Overexpression of OsMBL1 Enhances Rice Resistance to
M. oryzae

OsMBL1过表达植株中展示出十倍减少的真菌定植量。为了寻找OsMBL1在PTI中的作用，我们衡量了OsMBL1中ROS的爆发，然后发现在OsMBL1过表达植株中几丁质诱导的ROS的积累出现更早且强。将OsMBL1 RNAi后，在日本晴背景中，病斑长度更大。

8.MoChi1 Competes with OsMBL1 for Chitin Binding and
Suppresses Chitin-Induced ROS in Rice Cells

植物病原菌释放的低聚糖可以被宿主PRR识别，从而启动防御反应。预测糖基磷脂酰肌醇位点锚定在OsMBL1C端，提示该蛋白可能与质膜相联系。烟草瞬时表达和稳转材料都揭示OsMBL1在质膜上。

为了查明OsMBL1是否结合几丁质，纯化的GST-OsMBL1与不同的多糖进行孵育。结果显示，OsMBL1与不溶性的几丁质beads、crab shell chitin、chitosan、来自稻瘟病的细胞壁成分、来自稻瘟病的chitin和纤维素都有共沉淀，这就揭示了OsMBL1能够结合稻瘟病的细胞壁、几丁质和纤维素。

稻瘟病中的LysM效应子 Slp1竞争性抑制几丁质受体CEBiP，并且抑制了几丁质触发的免疫反应。往GST-OsMBL1溶液中滴定SSB-MoChi1-6XHis，然后再加入chitin beads。我们观察到添加的MoChi1的量与用几丁质珠拉下的OsMBL1的量呈负相关(随着SSB-MoChi1-6XHis浓度的增加，PULL DOWN下来的OsMBL1量减少，而MoChi1的量变多；反过来也发现随着OsMBL1的量增加，MoChi1的量也减少)。这些结果说明，MoChi1与OsMBL1竞争性的结合chitin。体内试验的话，就用ROS burst作为marker，用纯化的蛋白来孵育。
最后是model图。

OsMBL1_model.png