初学者带你了解基因编辑CRISPR，如何设计gRNA

首先要知道什么是CRISPR（/ˈkrɪspər/）？

因为CRISPR是”clustered regularly interspaced short palindromic repeats“，直接翻译就叫”常间回文重复序列聚集“。 简单些，CRISPR是存在于细菌中的一类基因组，该基因组中含有曾攻击过该细菌的病毒的基因片段。细菌会通过这些基因片段来侦测并抵御类似的病毒攻击。这类基因组是细菌免疫系统的关键组成部分。

CRISPR 与CRISPR/Cas9的关系？

人们通过利用细菌里的这类CRISPR基因组，可以有效编辑有机体内的部分基因，这一技术，叫做CRISPR/Cas9基因编辑技术。

什么是CRISPR/Cas系统？

CRISPR/Cas系统是目前存在于多数细菌与绝大多数古菌里的后天免疫系统，以消灭外来质体或者噬菌体。并在自己体内留下外来的基因片段作为“记忆”。目前主要有三类这样的系统根据不同的Cas核酸酶来分类的。其中二型的比较简单，是以Cas9核酸酶以及向导RNA（gRNA）为核心组成。还有核酸酶比如，Cpf1，就是CRISPR/Cpf1系统。

如果要使用CRISPR/Cas9系统对基因组进行编辑，第一步也是最重要的一步，就是要设计gRNA。

设计gRNA，需要在基因组中找到适当的目标序列。

基因组里的靶点，要涵盖以下特征：

1. 长度大约在20个核苷酸。
2. 后面（或者前面）是PAM序列。PAM序列会随Cas9来源的菌种不同而变化，gRNA需要与菌种一致。

设计的gRNA，要求：

1. 不包含PAM序列。
2. 可以是基因组DNA的任意一条链。
3. 如果要Cas9破坏基因组，gRNA靶点应该靠近蛋白编码N端，以便增加基因破坏的可能性。
4. 如果要Cas9对基因组作编辑或者修饰，gRNA靶点将限于编辑或者修饰的位置。
5. 选择生物信息学软件来设计，避免脱靶现象。如下：

张锋实验室的Target Finder：http://crispr.mit.edu/

Michael Boutros实验室的E-CRISP：http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html

CasFinder：http://arep.med.harvard.edu/CasFinder

CRISPR Optimal Target Finder：http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/

Reference：

1. http://www.ebiotrade.com/newsf/2015-1/2015116173729437_2.htm