bismark甲基化测序数据（WGBS、RRBS）处理流程傻瓜教

2023-07-25 本文已影响0人啊圆_669b

对自己这段时间魔鬼式修行linux的总结
因为自己是小白，所以写了小白也能看懂的傻瓜教程
（第一次写教程，有错还请大佬们指出）

1、数据下载

bismark要求fastq的数据格式，找到感兴趣的数据集（或者自己的实验数据）后，使用各种各样的方式下载数据。
sra数据的下载依赖网络，prefetch和wget等等用下来，感觉都不太稳定，且sra格式还需经过转换成fastq格式才能使用，我个人用着感觉容易发疯，后来使用IDM下载数据，香多了。

IDM破解版，看看群友有没有，我就是找群友要的，或者自己找下渠道吧，可以简信我要。

首先去ENA数据库搜索所需的数据集（https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/home）

ENA.png

进入数据集页面后点击“Generated FASTQ files: FTP”上方的“Download All”，再点击“yes”之后，下载可得到fastq文件的下载地址，会自动写为wget代码格式。使用excel表格的“分列”功能，将wget nc与网址隔开，我们只需要网址。

fastq.png

得到fastq下载网址之后，将文件格式另存为“文本文件”，因为IDM导入需要“文本文件”格式才能识别。
然后打开IDM，点击软件左上角的“任务”→“导入”→“从文本文件导入”，之后全选网址，选择数据下载的output file，然后就可以坐等IDM下载完成了。

IDM.png

IDM下载完成之后，将数据上传至linux服务器。

上传时间漫长，这时候看看文章里作者是如何处理数据的。

到此，数据下载完毕。

2、软件准备

bismark

要用bismark处理数据就当然要下载bismark了。
（所有软件都是下载到服务器里而不是电脑上，此软件非电脑软件应用程序。）
推荐使用conda下载，比较无脑。
要用conda下载首先需要一个conda
自己上网搜conda安装与配置的教程

conda下载命令非常简单
conda install xxxx
（xxxx泛指所需软件）
如：

conda install bismark

bismark也可通过官网获取包下载网址后上传至服务器再解压使用。

wget https://github.com/FelixKrueger/Bismark/archive/0.22.3.tar.gz

tar xzvf Bismark-0.22.3.tar.gz

一个非常重要的事情：为软件永久配置环境变量
操作如下，输入

vim ~/.bashrc

输入以上代码之后会出现一个界面，按e键进入edit编辑模式即可
之后滑动鼠标滚轮至编辑页面的最下方，输入

export PATH=$PATH:/home/xxx/Bismark-0.22.3

（PATH指的是你bismark的绝对路径，xxx指服务器里你的用户名字，根据实际情况修改即可，bismark后面跟的数字跟我不一样说明版本不一样而已，问题不大）
然后按一下esc键退出编辑模式，再输入

:wq

（:wq即可保存退出）
再输入

source ~/.bashrc

即可永远配置bismark的环境变量

bismark -help

即可查看bismark是否可以正常使用

bowtie2

下载bowtie2

conda install -y bowtie2

可以上网搜一下bowtie2的安装指南

也需要为bowtie2配置环境变量

vim ~/.bashrc

按e键

export PATH=$PATH:/home/xxx/bowtie2-2.5.1-linux-x86_64

按esc键

:wq

source ~/.bashrc
bowtie2 -help

即可查看bowtie2是否可以正常使用

fastqc

conda install -c bioconda fastqc=0.11.9

我发现去fastqc官网下载fastqc的源包，再上传到服务器然后解压之后，还需要手动为fastqc配置java环境，我是配崩溃了，建议大家用conda下载，不需要为它手动配一个java环境。

fastqc -h

能正常使用fastqc的话就不需要为它配置环境变量，否则需要配置。

cutadapt

输入python查看服务器的python版本，貌似几就能用cutadapt吧

python

下载cutadapt

python3 -m pip install --user --upgrade cutadapt

配置cutadapt环境变量
找不到cutadapt的话可以输入

whereis cutadapt

或者python下载完成之后会显示软件下载到哪去了

vim ~/.bashrc
#按e键
export PATH=$PATH:/home/xxx/.local/bin
#按esc键
source ~/.bashrc
cutadapt -help

samtools

conda install samtools
whereis samtools

需要的话就为samtools配置环境变量吧

3、下载参考基因组

参考基因组有很多（hg19、hg38、GRCh37等等），具体参照文章作者使用的参考基因组进行下载。
建议上网搜索参考基因组的教程
我是使用了hg19，在家目录下创建了hg19的文件夹，最终得到了hg19.fa文件