qPCR引物设计

原创 如期生物

常规基因表达量qPCR检测，首要的是设计一对特异的检测引物，下边如期生物以人的“FAU1”基因为例给大家简要介绍一下如果使用NCBI这个网站设计qPCR

打开NCBI网站：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/；界面如下

在NCBI搜索栏下拉框选择“Gene”；输入框输入对应的物种及基因信息，并点击“Search”键进行搜索如下所示

点击“search”后，跳转到如下界面；单击对应的基因项

点击基因名称后，跳转到如下界面；拉到底部转录本位置

如下图，选择需要检测的转录本；并单击

如下图，单击“pick primers”

修改设计参数：“PCR product size”设在70~150bp即可，太长会影响扩增效率；“Exon junction span”可选选择跨外显子排除基因组污染的干扰，不过目前市面上很多反转录试剂都带有去基因组的步骤，所以该选项不进行设置也可以 ；“Database”选项，选择Refseq RNA即可；最终参数设定如下，其他参数保留默认设置即可：

点击“get primers”选项，等待数据库匹配完后会出现如下界面：

然后选择GC百分比在45%-55%之间，Tm在60℃左右的引物，复制序列合成进行验证特异后即可用于qPCR检测。

如期生物引物设计合成及验证项目结果示例：