被子植物·叶绿体组装、注释与比较分析·框架

（1） 组装：GetOrganelle

  Manual提供了三种参数配置模式：均衡、草图、内存经济型（慢速）模式。
  Manual: https://github.com/Kinggerm/GetOrganelle/wiki
  Toturial: https://github.com/Kinggerm/GetOrganelle
  GetOrganelle组装结果包含两个*path_sequence.fasta文件，是因为SSC正向/逆向在任意被子植物中均可能存在^[1]，使用哪一个用于后续分析的选择依据可以是参考基因组或NCBI中较多上传的那一种SSC方向的组装。
  具体而言，利用Gepard软件实现^[2]，安装后，需在java环境下运行（windows下运行很方便）。该软件用于两条序列的共线性分析，输出二维点图。命令行的使用参考：Gepard Linux Command line mode

Fig. 1 REF of Cas_hy vs. cas004-2
Fig. 2 REF of Cas_hy vs. cas004-1
  先前听说GetOrganelle所得标注为graph1.1的即为SSC正确方向，目前看来并不一定，一般选用图一的序列，然而我得到的graph1.1与参考比较如图2所示。分析操作参考B站。
  组装准确性检验：①多软件多次组装，互相比较；②CSDN博主提供了一种基于测序质量的逆向组装检验思路^[2]。

（2） 软件注释：PGA

  Toturial: https://github.com/quxiaojian/PGA
  中文教程（开发者）：https://www.jianshu.com/p/6ac8a9fad9c9?native.theme=1

（3） 完善注释：Geneious

  之所以需要完善注释结果，首先是因为不同物种拥有的基因本身可能不同，其次是一些序列区域可能存在模棱两可的启动子或终止子，软件无法断定哪一个位置是基因的起点或终点，另有一些属于程序算法误差，因此需对此核对。即——
  ① PGA的.log文件可能显示有个别基因没有注释出来：用Geneious将参考中的该基因筛选出来，然后以组装序列为参考，blastn该基因，如果存在高一致性区域，则查看碱基位，利用Geneious手动添加注释^[5]。
  ② PGA的.log文件可能显示某基因启动子或终止子不是常用密码子之类：我的做法是利用Geneious查看参考基因组该基因的起始与终止区序列，手动修改。
  ③ 其他错误：具体问题具体分析。

（4） ……（待续）

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参考文献：

[1] Sources of inversion variation in the small single copy (SSC) region of chloroplast genomes: https://bsapubs.onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.3732/ajb.1500299
[2] GENOME PAIR RAPID DOTTER (GEPARD): https://cube.univie.ac.at/gepard
[3] 如何检查叶绿体基因组组装结果的准确性v1：https://blog.csdn.net/weixin_43362619/article/details/120707968
[4] 叶绿体基因组的GetOrganelle组装、批量任务和结果合并–3. GetOrganelle多个组装结果的合并：https://www.jianshu.com/p/b31304beebe0
[5] 叶绿体基因组注释PGA篇：https://blog.csdn.net/salty_fish_xu/article/details/127469339