读书笔记2

    2013年美国陶氏益农公司申请了《FAD2性能基因座及相应的能够诱导扩展断裂的靶位点特异性结合蛋白》专利。

      它以位点不同的方式剪切细胞中的FAD2基因中的靶位点，从而在该FAD2基因中产生断裂；其中该FAD2基因在剪切之后被修饰。它可以以任一项的方法，其中位点有所不同的方式的剪切是对FAD2A，FAD2A'，FAD2C和/或FAD2C'的某些复制但非所有复制副本的。

    用于复制剪切基因组DNA的方法和组合物。这些剪切事件能够用于，例如，诱导突变突变，​​诱导细胞DNA序列的复制删除，和例如，Urnov et al。（2010）Nature 435（7042）：646-51;促进在预定染色体基因座处的重组和整合。

    在实施方案中，这样的仍然可以包含核酸酶（剪切）结构域或半结构域和/或连接酶结构域，使该片段可以诱导双链断裂，和/或易化认知核酸在断裂位点的重组。

在特定的实施方案中，靶向FAD2基因座的DNA结合结构。在域可以是DNA剪切功能结构域。互补的可以用于将外源核酸寄到宿主生物体（例如植物或动物物种）基因组的一个或多个FAD2基因座处。在某些实施方案中，DNA结合结构域包括具有一个或多个锌指，并可以被工程化（是非天然出现的 ），从而结合FAD2基因内的任何序列。本文所述的任何锌指蛋白均可以结合靶基因编码序列内或相邻序列内。锌指蛋白结合FAD2基因内部的靶位点。

    可以用于破坏或编辑FAD2基因的方法。根据本文还描述了通过根据本发明实施方案的方法产生的遗传修饰的宿主生物体（例如转基因植物）。在特定的实施例中，根据本发明实施方案的方法产生的转基因生物体可以是，但不限于，藻类，淀粉，单子叶植物，双子叶植物，等。

    表达人ACE2基因，同样也可以剪切，复制。。。。

    转基因植物可以是任何能够根据本文所述的方法被核酸转化、该 核酸随后整合到至少一个FAD2基因座中的植物。因此，植物可以是双子叶植物或单子 叶植物。可用于本方法的双子叶植物的非限制性实例包括拟南芥，紫花苜蓿，豆类，西兰 花（broccoli)，卷心菜，芥花，胡萝卜，花椰菜（cauliflower)，序菜，大白菜，棉花，黄瓜， 茄子，萬苣，甜瓜，豌豆，胡椒，花生，马铃薯，南瓜（pumpkin)，萝卜，油菜，菠菜，大豆，倭瓜 (squash)，甜菜，向日葵，烟草，番茄，和西瓜。可用于本方法的单子叶植物的非限制性实例 包括玉米，大麦，洋葱，水稻，高粱，小麦，黑麦，粟，甘蔗，燕麦，黑小麦，稷，和草坪草。根据本 发明的转基因植物可以用任何方式使用或培养。

    完全表征了所有4个FAD2基因的全基因组序列之后，设计锌指核酸酶用 于结合每个特定基因家族成员的序列。

    设计和构建编码锌指核酸酶的表达载体和特异针对FAD2A的供体载体，为了通过NHEJ整合供体序列，构建了单个供体载体。该载体编码yige dsRED 报告基因表达盒。该dsRED报告基因表达盒包括拟南芥泛素10启动子（Callis，et al.，1990, J. Biol. Chem.，265:12486-12493)，随后是 dsRED 基因（Dietrich et al. (2002) Biotechniques 2 (2): 286-293)。dsRED基因被密码子优化用于在双子叶植物中表达，并且 侧翼是含有根癌土壤杆菌pTil5955开放阅读框23 (0RF23)的转录终止子和聚腺苷酸化位 点的 3'UTR(Barker et al, Plant Molecular Biology 1983, 2(6)，335-50)。可选择标记 盒包括与pat转基因融合的CsVMV启动子。pat转基因终止于根癌土壤杆菌pTil5955开放 阅读框 1(0RF1) (Barker et al, Plant Molecular Biology 1983, 2 (6) ,335-50)。dsRED 抗 性盒被克隆到每个载体的特异限制酶位点，产生"供体"载体：pDAS000097(SEQ ID N0:88， 图16)。pDAS00097供体被设计为作为线性DNA或环状DNA投送到植物细胞中，并在ZFN PDAB104010剪切FAD2A基因座时整合在FAD2A基因座内。线性DNA介导的整合是线性化 PDAS000097质粒在转化过程中整合到植物细胞中的结果。该质粒可以通过独特限制位点处 的剪切被线性化。环状DNA介导的整合是环化PDA000097质粒在转化过程中整合到植物细 胞中的结果。PDAS000097被修饰成含有能够被ZFP24828-2A-24829锌指核酸酶切割的锌指 结合位点。环状质粒PDAS000097在植物细胞中被pDAB104010编码的锌指核酸酶切割，并 且dsRED基因盒被整合到FAD2A基因组基因座中。