ceRNA机制研究案例(四)
一、调控通路
当LncRNA BC032469低表达时,miR-1207结合到hTERT mRNA的3’-URT抑制mRNA翻译表达蛋白,当LncRNABC032469高表达时,LncRNA BC032467作为miR-1207的海绵吸附体解除其对hTERT mRNA翻译的抑制,从而促进hTERT蛋白的表达。
二、实验流程
作者首先对临床样本的胃癌组织和癌旁组织进行免疫组合检测hTERT的表达,hTERT在胃癌细胞中高表达,然后用LncRNA微阵列分析筛选出差异表达的lncRNA BC032469,再统计临床上胃癌病人的存活率与BC032469表达的关系。作者对LncRNA BC032469的研究分为两方面:功能和机制的研究。
(1)功能实验:先建立LncRNA敲低稳定株,然后通过MTT、克隆形成、流式细胞仪、小鼠体内成瘤成瘤实验检测LncRNA的细胞增殖的作用,另外作者通过免疫组化检测hTERT的表达说明LncRNA对hTERT表达的影响。
(2)机制实验:作者先用WB实验检测LncRNA敲低后的hTERT的表达表明LncRNA对hTERT表达有影响,然后通过荧光素酶实验验证LNcRNA并不影响hTERT启动的活性,表明LncRNA对HTERT表达的影响不是在转录水平上的。随后作者对LncRNA敲低后的microRNA表达谱分析筛选出表达差异的miR-1207,然后通过荧光素酶实验验证hTERT 3’-urt与miR-1207和LncRNA的关系,表明LncRNA通过与miR-1207结合解除miR-1207对mRNA表达的抑制。另外,作者用斑点印迹法检测miR-1207与hTERT 3’-UTR和LncRNA的结合。作者在最后通过RNA-FISH的方法在细胞内验证LncRNA与miR-1207的结合。
三、核心Figure
LncRNA敲低后hTERT表达降低,但不影响启动子活性,同时miR-1207-5p表达升高Figure1.说明的是LncRNA敲低后hTERT表达降低,但不影响启动子活性,同时miR-1207-5p表达升高。
A、 WB检测LncRNA敲低后hTERT蛋白的表达,表明LncRNA敲低后hTERT表达降低。
B、 荧光素酶实验检测LncRNA与hTERT基因启动子活性的影响,表明LncRNA不影响启动子活性。
C、LncRNA与microRNA的结合位点预测。
D、 LNcRNA敲低后检测microRNA的表达,筛选出差异表达miR-1207。
LncRNA通过作为miR-1207的海绵吸附体促进Htert的表达Figure2.说明的是LncRNA通过作为miR-1207的海绵吸附体促进Htert的表达。
A、 荧光素酶实验,通过LncRNA敲低,加入miR-1207的反向互补RNA和Htert 3’-UTR的miR-1207结合位点突变检测荧光素酶活性,表明了LncRNA通过与miR-1207结合调控Htert 3’-UTR。后图是用miR-1266作为对照组。
B、 通过LncRNA敲低,加入miR-1207的反向互补RNA、miR-1266反向互补RNA后检测Htert的表达,表明了LncRNA通过与miR-1207结合促进Htert的表达。
C、斑点印迹法检测miR-1207与hTERT 3’-UTR和LncRNA的结合。
D、 RNA–FISH,用miR-1207-5p和LncRNA探针进行免疫荧光原位杂交,对细胞内的miR-1207-5p和LncRNA定位表明两者出现在细胞的同一位置。
参考文献:M-H Lü, B Tang,S Zeng,et al. Long noncoding RNABC032469, a novel competing endogenousRNA, upregulates hTERT expression bysponging miR-1207-5p and promotes proliferation in gastric cancer[J]. Oncogene,2015,1 – 11