家族性MDS和AML的复杂遗传景观揭示了致病性种系变异
The complex genetic landscape of familial MDS and AML reveals pathogenic germline variants
摘要
将家族性髓系恶性肿瘤作为一个单独的疾病实体纳入修订的世卫组织分类中，重新努力提高对这一高危人群的认识和管理。在这里，我们报告了86个急性髓系白血病(AML)和骨髓增生异常综合征(MDS)家族的队列，其中49个在先前定义的16个位点中包含种系变异(57%)。另外37个未被描述的家族(43%)的全外显子组测序使我们对65个新的候选位点进行了合理性分析，包括罕见血液综合征中突变的基因(ADA,GP6, IL17RA, PRF1和SEC23B)，既往MDS/AML或遗传性骨髓衰竭系列(DNAH9, NAPRT1和SH2B3)或新位点变异(DHX34)的报告，这些新位点变异似乎是特异性于遗传形式的髓系恶性肿瘤。总之，我们的MDS/AML家族系列为髓系恶性肿瘤的病因学提供了新的见解，并提供了一个框架，为纳入常规诊断和患者管理对变异进行优先排序。
介绍
髓系恶性肿瘤的遗传形式被认为是罕见的，尽管确切的发病率和流行率尚不清楚。家族性髓系恶性肿瘤作为一种独立的疾病实体于2016年列入世界卫生组织(WHO)血液系统癌症分类，并得到欧洲白血病网(ELN)的承认，这使得人们对这些可遗传形式的疾病的存在有了更大的认识。它也强调了早期诊断和对这一患者和家庭进行量身定制的管理的重要性。家庭不仅可以从适当的遗传咨询和长期监测中受益，文献中有几个例子报道了无症状家庭成员移植后供者源性恶性肿瘤，以及修改调理方案对骨髓移植前存在潜在端粒酶突变的患者的益处。
临床识别家族性传播具有挑战性，因为家族规模往往较小，发病率往往被疾病潜伏期和表型的显著差异所掩盖，而缺乏常规定制的家族性诊断检测则加剧了这种情况。与儿童发病相比，成人发病的问题更为严重，儿童发病时对治疗医生的怀疑可能更高，恶性肿瘤可能作为更广泛综合征的一部分出现。许多患者/家庭最初表现为骨髓衰竭综合征，如Fanconi贫血、先天性角化不良和Shwachman-Diamond综合征，容易发展为骨髓增生异常综合征(MDS)或急性髓系白血病(AML)。
20年前，转录因子RUNX1中的遗传变异被认为是导致家族性血小板紊乱并有发展AML (FPD-AML)倾向的罪魁祸首。随着下一代测序方法的普及，我们现在已经发现了20多个与可遗传髓系恶性肿瘤相关的基因(表1)，其中大量新描述的位点似乎局限于几个核心家族(ATG2B/GSK1P, ETV6,SRP72)。在散发的AML/MDS (RUNX1,CEBPA, GATA2)中，这些家族基因位点也发生突变，而其他基因位点则表现为丰富或专为遗传性髓系恶性肿瘤(DDX41)。这些例子提供了对髓系恶性肿瘤潜在病因学的独特见解，并提供了机会来了解疾病潜伏期、外显率和显著的临床内和临床间异质性背后的原因，这些异质性是许多此类家族的特征。
为了解决这个问题，我们分析了迄今为止最大系列的AML/MDS家族。它体现了遗传性AML和MDS的分子异质性，在49个(57%)家族中检测到16个先前定义的位点中可能存在致病变异。另外37个“未定性”家族(43%)的全外显子组测序(WES)关注65个候选基因中的144个变异，其中26个(40%)在散发性AML病例中发生突变。这包括罕见血液病综合征(ADA,GP6, IL17RA, PRF1, n dSEC23B)的基因突变，先前MDS/AML或遗传性骨髓衰竭(IBMF)系列(DNAH9, SH2B3, nDNAPRT1)报道的基因突变，或已确认的种系变异体功能丧失的新位点(DHX34)。
方法
病人和家族
来自86个家庭的221名个体被纳入研究。在每个家庭中，有两个或更多的家庭成员(通常是一级亲属)被诊断为血液学疾病(主要是AML、MDS、再生障碍性贫血或血小板减少症)，至少有一个受影响的病例被归类为MDS或AML。在我们当地研究伦理委员会的批准下，纳入研究的患者和无症状家庭成员给予了书面同意(London-City and East, REC reference 07/Q0603/5)。外显子组测序和候选基因测序使用了来自全外周血、骨髓标本、唾液或皮肤成纤维细胞的基因组DNA。
Targeted sequencing
利用位于英国伯明翰的西米德兰兹区域遗传实验室(WMRGL)的认证检测机构(https://www.geneadviser.com/genetictest/familial_mds_familial_aml_sequencing_birmingham)，对每个家庭的索引病例进行了10个已知疾病基因(ACD、ANKRD26、CEBPA、DDX41、ETV6、GATA2、RUNX1、SRP72、TERC和TERT)的靶向测序。如果这些变异之前被描述为与家族性MDS/AML或符合以下标准的新变异(SNVs或indels)相关，则被认为是致病的:(1)健康人群中较小的等位基因频率(ExAC和gnomAD数据库)<0.00001，(2)变异等位基因频率>30%，(3)预测致病的四种功能注释工具中的两种(PolyPhen2, MutationTaster, SIFT和Proveen)，(4)有足够的致病性证据，且不符合ACMG指南下良性断言的任何标准;(5)在实际情况下，与受影响个体隔离。
一个由33个MDS/AML基因(ASXL1(第12外显子)、BCOR(全部外显子)、CALR(第9外显子)、CBL(第7+8+9外显子)、CEBPA(全部)、CSF3R(第14 - 17外显子)、DNMT3A(全部)、ETV6(全部)、EZH2(全部)、FLT3(第14+15+20外显子)、GATA2(全部)、GNAS(第8+9外显子)、IDH1(第4外显子)、IDH2(第4外显子)、IKZF1(全部)、JAK2(第12+14外显子)、KIT(第2、8 - 11外显子)、13 + 17),喀斯特(外显子2 + 3),MPL(外显子10),NPM1(外显子12),国家管制当局方面(外显子2 + 3),PDGFRA(18)外显子12日,14日,PHF6(所有),PTPN11(外显子3 + 13),RUNX1(所有),SETBP1(外显子4),SF3B1 (cbt)外显子),SRSF2(外显子1),TET2(所有),TP53(所有),U2AF1(外显子2 + 6),WT1(外显子7 + 9)和ZRSR2())来确定后天变异的五germlineDHX34variants患者。采用内部的True SeqCustom Amplicon (TSCA)设计(Illumina, San Diego, California, USA)进行目标浓缩。混合库目标在MiSeq测序平台上进行测序。最小读深阈值为150，灵敏度下限为5-10%变异等位基因频率(VAF)。
全外显子测序
使用Agilent SureSelectXT Target Enrichment System for Illumina Paired-End Multiplexed Sequencing文库，结合Agilent SureSelectXT Human所有外显子v6捕获试剂，从200 ng基因组DNA制备WES文库。库在NextSeq 550测序器上使用高输出300循环试剂盒进行测序，产生150 bp成对端单index reads。
WES数据根据Pontikos(https://github.com/UCLGeneticsInstitute/DNASeq_pipeline)中描述的管道进行处理。使用Novoalign(版本3.02.08)对简短的读取数据进行对齐。变体和索引是根据GATK(版本3.5)最佳实践调用的。使用UCLex联盟的2500个WES内部控制样本进行联合呼叫和变异质量评分重新校准，以最小化平台特定变异和人工批量效应。然后使用Variant Effect Predictor对这些变量进行注释，输出为JSON格式，由Python脚本进行后处理，并加载到Mongo数据库中。这个过滤是使用一个定制的R脚本来过滤掉变体的。ExAC和GnomAD中外源等位基因频率阈值小于0.005或缺失的作为下一步应用。测序深度<20或基因组片段复制区域的变异也被过滤掉。
sanger测序
WES在23个候选基因中鉴定出48个变异，通过Sanger测序进行验证。PCR反应扩增每个变异使用1.1× ReddyMix™(Life Technologies)和纯化的PCR片段(QIAquick凝胶提取试剂盒;Qiagen, Venlo，荷兰)由GATC Biotech (Eurofins, Ebersberg, Germany)进行测序。所使用的寡核苷酸序列见补充数据10。
RUNX1缺失检测: 阵列CGH, SNP阵列和MLPA
由于我们的靶向测序面板没有捕捉到结构异常，结合阵列比较基因组杂交(全息阵列)或SNP数组和多路复用Ligation-dependent探测器放大(MLPA)是用来确定生殖系RUNX1缺失在三个家庭与家族性血小板障碍的临床特征与倾向髓系恶性肿瘤(FPDMM)从我们的队列(FML029,FML030和FML031)。Agilent™是一个定制的2×400k寡芯片，用于家族FML029 (II.5)和FML031 (II.2)，分析CNAs与家族性MDS/AML和IBMF综合征相关的基因(RUNX1、GATA2、CEBPA、SRP9、SRP14、SRP19、SRP54、SRP68、SRP72、MPL、DKC1、TERT、TERC、NOP10、NHP2、TINF2、CTC1、C16ORF57、TCAB1)。根据制造商的协议，将FML030家族II.2的DNA样本杂交到the Affymetrix Cytoscan HD阵列。使用Affymetrix染色体分析套件(CHAS) 2.1进行拷贝数分析。使用专为家族性MDS/AML位点(P437-A1 Probemix, MRC Holland)定制的MLPA分析对三个家族中发现的新runx1缺失进行验证和分离分析(可能的话)。使用Peak Scanner软件v1.0(应用生物系统，CA)分析每个样本获得的原始数据。
端粒长度测量
端粒长度测定采用单色多重定量PCR方法。简单地说，在每个基因组DNA样本中，使用标准曲线在实时PCR反应(Roche LightCycler)中定量端粒DNA (T)和单个拷贝基因(S)的数量。这就给出了一个T/S比，它与端粒长度成正比。样本以4个重复的形式运行，并与225个健康对照的T/S比值范围进行比较。
DHX34功能验证
质粒pcG T7-DHX34, pcDNA3-3XFLAGUPF1构建和siRNA之前已经被描述过55。以DHX34全长为模板，通过PCR扩增克隆出DHX34变异体。引物序列可根据要求提供。首先，按照制造商的说明，使用Dharmafect I (Life Technologies)转染25 nM siRNA, 24小时后扩展。72h后，将75 nM siRNA转染细胞，同时转染20µg pcDNA3xFLAG-UPF1和20µg表达siRNA抗性野生型或突变型T7-DHX34蛋白的质粒，也包括空载体对照。48小时后收获细胞，使用Anti-FLAG M2亲和凝胶(A2220;Sigma-Aldrich)。western blotting分析蛋白复合物，使用Phospho-(Ser/Thr) ATM/ATR Substrate (2851;细胞信号)抗体。用anti-FLAG (F1804, M2克隆;SigmaAldrich)，并进一步用抗upf2 (sc-20227;圣克鲁兹)和抗upf3b (sc-48800;圣克鲁兹)抗体，如前所述55。使用ImageQuant LAS 4000系统(GE医疗)检测信号，并使用ImageQuant TL软件(GE医疗)进行量化。FLAG-UPF1和T7DHX34共免疫沉淀，分别用1个µg pcIneo-FLAG-UPF1和1个µg T7-DHX34或相应的空载体质粒转染6孔板培养的细胞。转染后24小时扩增细胞，48小时后收获细胞。使用anti-FLAG或anti-DHX34抗体检测FLAG-UPF1和T7-DHX34结构(Hug和Caceres之前描述的非商业抗体)。所有抗体均采用1/1000稀释。
结果和讨论
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