文献阅读 | GAM：基于ligation-free方法捕获基因

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原文链接：
Beagrie RA, Scialdone A, Schueler M, et al. Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping. Nature. 2017 Mar 23;543(7646):519-524. doi: 10.1038/nature21411. Epub 2017 Mar 8. PMID: 28273065; PMCID: PMC5366070.
https://www.nature.com/articles/nature21411

数据预处理

I. Alignment

使用Bowtie2（默认参数）将read mapped 到 mm9 参考基因组
仅保留MAPQ>=20 read
去除PCR duplicates

II. Calling positive windows

首先，将全基因组分为一系列连续bins（i.e. equal-sized windows）

III. Exclude low-quality datasets

作者共产生了471个nuclear profiles + 5 negative control 共477个样本
作者考察了以下质量指标：

% of mapped reads
% of non-PCR duplicate reads
average sequencing quality
Mononucleotide repeat score
Dinucleotide repeat score
total number of windows scored positive
number of positive windows immediately adjacent to another positive window
number of positive chromosome for each sample

使用以上所有质量指标作为特征，对所有477个样本进行主成分分析，发现 % of mapped read 指标是区分 nuclear profile 和 negative control 最有效的特征。

negative controls 中 % of mapped reads 最高为2%。严格起见，作者将 % of mapped reads 小于 15% 的细胞全部过滤掉，共过滤掉63个细胞，剩余408个高质量细胞。

Calculation of linkage matrices

假设：
（1）位点 $A$ 被检测到的频率为 $f_A$ ，位点 $B$ 被检测到的频率为 $f_B$
（2） $f_{AB}$ 是位点 $A$ 和 $B$ 同时被检测到的频率

定义Linkage disequilibrium
$D = f_{AB}-f_Af_B$
使用 linkage $D$ 的理论最大值 $D_{max}$ 对 $D$ 进行归一化，得到Normalized Linkage disequilibrium
$D' = \frac{D}{D_{\max}}$
其中 $D_{max}$ 的计算方法为：
$D_{\max} = \begin{cases} min(f_af_b, (1-f_a)(1-f_b)) & D<0 \\ min(f_b(1-f_a),f_a(1-f_b)) & D \geq0 \end{cases}$

染色质三维结构识别

compartment A/B

GAM识别compartment A/B的方法与Hi-C基本相同，具体过程如下：

使用normalized linkage matrices 替代 normalized contact matrices，记为原始矩阵为 $O$ 。
对 $O$ 按距离进行切片，定义片内所有locus pair的均值为该片的期望，即
$E(i,j) = average\{ O(i', j') | dist(i,j)=dist(i',j') \}$
定义 $K(i,j) = O(i,j) / E(i,j)$
计算 $K$ 的 Pearson 相关系数矩阵为 $C$ ，即
$C(i,j) = corr(K_i, K_j)$
以 $C$ 为特征矩阵，进行主成分分析（PCA），提取前3个主成分
选择与GC含量相关最高的主成分，用于定义compartment A/B

TAD

TAD的计算参考了 2015 Crane et al. [1] 提出的用于Hi-C数据的 insulation score方法。
使用 3 x 3 window box 沿对角线滑动，计算每个window box内的normalized LD的平均值。

使用SLICE识别 prominent interacting locus

interacting locus pairs

Figure 3a

核心思想：
假设基因组中的两个位点 $A$ , $B$ 在 $m$ 个NP中：
- $m_0$ 个既没有检测到A，也没有检测到B
- $m_1$ 个检测到 $A$ 或 $B$ 中的一个
- $m_2$ 个同时检测到 $A$ 或 $B$

定义 $A,B$ 的共出现（co-segregation）频率为
$m_2 / (m_1 + m_2）$

则当 $A$ 与 $B$ 的互作频率为 $\pi$ 时，根据SLICE model（详见《文献阅读 | GAM：基于ligation-free方法捕获基因组中增强子间的复杂互作 (Part III：SLICE 统计学模型）》可以计算得到co-segregation ratio服从的分布，并进行统计学检验： $H_0:\{ \pi =0 \}$ v.s $H_1: \{ \pi > 0 \}$ 。
具体而言，计算 $\pi=0$ 时的分布的95%分位值 $t$ ，当 $\frac{m_2}{m_1+m_2}>t$ 时，即认为 $A,B$ 间存在显著互作。

此外，对于prominent interacting pairs，SLICE model还可对 $\pi$ 进行估计（即Figure 3)

Interacting locus triplets

类似地，定义triplet co-segregation ratio 为
$m_3 / (m_3 + m_2 + m_1)$

参考文献

[1] Crane, E., Bian, Q., McCord, R. et al. Condensin-driven remodelling of X chromosome topology during dosage compensation. Nature 523, 240–244 (2015). https://doi.org/10.1038/nature14450