DNA甲基化及其基本功能
2019-01-24 本文已影响22人
Thinkando
1. 介绍
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- DNA甲基化途径。DNA甲基转移酶家族（Dnmts）催化甲基从S-腺嘌呤甲硫氨酸（SAM）转移至胞嘧啶残基的第五个碳，形成5-甲基胞嘧啶（5mC）。（a）Dnmt3a和Dnmt3b是从头 Dnmts并将甲基（红色）转移到裸DNA上。（b）Dnmt1是维持Dnmt并在复制期间维持DNA甲基化模式。当DNA经历半保守复制时，亲本DNA支架保留原始DNA甲基化模式（灰色）。Dnmt1与复制灶相关联，并通过在新形成的子链（蓝色）上添加甲基（红色）来精确复制原始DNA甲基化模式。
2. DNA甲基化的位置
- 基因区间
- 主要作用是是抑制潜在有害遗传元件的表达。（如插入的病毒原件）
- CpG群岛
- CpG岛是大约1000个碱基对的DNA片段，大多数基因启动子（大约70％）位于CpG岛内，CpG岛的甲基化可损害转录因子结合，募集抑制性甲基结合蛋白，并稳定沉默基因表达。
- 基因体
- 基因体的DNA甲基化如何促进基因调控仍不清楚
3. DNA甲基化的基本机制
- 甲基化的三类酶： writers, erasers, and readers.
- Writers are the enzymes that catalyze the addition of methyl groups onto cytosine residues. （建立）
- Erasers modify and remove the methyl group. （删除）
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Readers recognize and bind to methyl groups to ultimately influence gene expression. （识别）
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- 活性DNA去甲基化途径。5-甲基胞嘧啶（5mC）可在两个位点进行化学修饰：胺基和甲基。5mC的胺基可以通过AID / APOBEC脱氨（绿色），将5mC转化为胸腺嘧啶（Thy）。5mC的甲基可以通过添加由Tet酶介导的羟基来修饰，以产生5-羟甲基 - 胞嘧啶（5hmC）。5hmC也可以在两个位点进行化学修饰：胺基和羟甲基。AID / APOBEC可使5hmC脱氨（绿色）以产生5-羟甲基 - 尿嘧啶（5hmU）。在5hmC的另一个化学途径中，Tet可以进一步氧化（蓝色）5hmC以形成5-甲酰基 - 胞嘧啶（5fC），然后是5-羧基 - 胞嘧啶（5caC）。最终，每个途径的产品-Thy，5hmU，5fC，
4. DNA甲基化和其他表观遗传机制的串扰
- DNA甲基化与组蛋白修饰和microRNA（miRNA）一起调节转录。在真核生物中，DNA与组蛋白结合，有助于将长链DNA包装到小核区。将包括甲基化，乙酰化，遍在蛋白化和磷酸化的化学修饰添加到N-末端组蛋白尾部的三个特定氨基酸上。这些修饰不仅影响DNA链的包装方式，还影响其转录活性。松散DNA与组蛋白结合的组蛋白修饰通常为转录提供了允许的环境，而紧密包装DNA和组蛋白的组蛋白修饰抑制了基因表达。Dnmts直接与调节通常参与基因抑制的组蛋白修饰的酶相互作用（图3）。已知Dnmt1和Dnmt3a都与组蛋白甲基转移酶SUV39H1结合，后者通过H3K9上的甲基化来限制基因表达（Fuks 等，2003）。此外，Dnmt1和Dnmt3b都可以结合组蛋白脱乙酰酶，去除组蛋白的乙酰化，使DNA包装更紧密，限制转录的进入（Fuks 等，2000 ; Geiman 等，2004）。通常，Dnmts与组蛋白修饰酶配合，所述组蛋白修饰酶参与添加和/或剥离组蛋白标记，以便在基因区域上施加抑制状态。
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4. DNA的甲基化和羟甲基化测序
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DNA的甲基化是在DNA的序列不变的条件下，在其中某些碱基上加上甲基的这样一个过程。DNA甲基化的结果，一般是使甲基化位点的下游的基因表达量变少。
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- 化学反应：
- 这个（甲基化）分析方法当中的核心化学反应，是用亚硫酸氢盐来处理DNA。DNA当中，没有甲基化或羟甲基化的C碱基，就会被转化成U碱基。
- 我们来看这个转化的过程，在弱酸性条件下，亚硫酸氢根会结合到没有甲基化的C碱基的6位。而甲基化了的C碱基不会和亚硫酸氢根发生这个反应的。
- 然后，用碱来处理。结合了亚硫酸氢根的非甲基化的C，就被脱氨基，并且脱亚硫酸根。然后，就被转化成U碱基。
- 那么，甲基化或者羟甲基化的C碱基，因为之前没有和亚硫酸氢根起反应，所以现在用碱来处理，它也不会发生脱氨基反应。所以，它还保持了是“C”。
- 用亚硫酸氢盐来处理DNA，可以让99%左右的非甲基化的C碱基变成U。
- 也就是说这种方法的的转化效率非常高，转化效率达到了99%。
- 它的优点，就可以让我们接下来通过高通量测序的方法，可以精确地看到单个碱基的甲基化的水平。
- 经过亚硫酸氢盐转化过的DNA，再经过PCR，PCR新合成出来的链，U碱基的位置，就会被替换成了“T”。那么在接下来的测序过程中，测到的也是T碱基。
- 而甲基化的C，因为没有被亚硫酸氢盐所转化，所以，在接下来的测序过程中，被测到的，还是“C”碱基。
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这样，通过测序，看一个位置是“C”，还是“T”。如果它保持是“C”，就说明这个位置是被甲基化、或者羟甲基化了。如果测到的是“T”，就说明这个位置是没有被甲基化、或者羟甲基化。
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- 建库方法：
- 接下来，我们谈一下甲基化的建库过程。
- 先说第一种，用Illumina公司的Truseq DNA建库方法，来做甲基化测序。
- 因为Illumina Truseq DNA建库试剂盒当中，它所提供的接头，那么这个接头上的C碱基都是已经经过甲基化修饰了。
- 所以，用这些接头做出来的文库，在用亚硫酸氢盐做转化的过程当中，它的（接头上的）C还是保持是C ，不会被转成U。
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带了这些接头的文库分子，就可以和测序芯片上的草皮DNA发生互补杂交。并且进一步发生桥式PCR反应。生成测序用的DNA的簇（Cluster）。
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- 但是，这个方法有一个缺点，就是在用亚硫酸氢盐处理DNA文库的时侯，90%以上的DNA链会断掉。这样，已经建好的文库，其中90%分子会被破坏掉。也就是说文库的丰富度就会损失90%以上。
- 那么，相应的它有它的好处，它的好处就是，在这个建库过程当中用的PCR循环数较少。所以它PCR扩增效率不同，所引起的文库不均一程度也就较低。也就是我们通常所说的PCR bias较少。
接下来，再说第二种建库方法。
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为了解决文库丰富度受到损失的这个问题，EpiCentre公司开发了EpiGnome方法，方法的操作过程如图。
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第1步，亚硫酸氢盐先处理DNA，把未甲基化的C都转变成U。
第2步，把带标签1的随机引物加入，进行第一次的复制。得到第1条的复制链。
第3步，是消化掉过量的引物。
第4步，是加入带末端终止碱基、并带标签2的随机引物。这个引物的作用是让第1复制链延伸，并且加上标签2。
第5步是加入建库的PCR引物，进行PCR。通过PCR，把Index序列和成簇引物序列加入到链的两侧。得到真正的文库。 - 这个方法的优点是，把亚硫酸氢盐处理的过程，放在了建库之前。这样建成的库的丰富程度会比较高。但是这个方法也有缺点，缺点就是要做较多的PCR循环，那么有了比较多的PCR循环之后，PCR产物的扩增均一性是不太好的。也就是说PCR bias会比较大。
- 上述两种方法，各有优缺点。
- 因为甲基化文库中经过亚硫酸氢盐处理，绝大多数的C都变成了T。所以，这个文库中是严重地缺少C碱基的，也就是四种碱基的比例是严重不平衡的。这样在用HiSeq 2000或2500测序仪来测甲基化文库的过程当中，文库测序得到的数据质理就较差。并且经过PF过滤得到的有效的数据产量也会较低。
- 为了弥补甲基化文库的碱基不平衡性，一般情况下，在上机过程当中，是掺入大比例的基因组文库，或者PhiX文库，来补充比较多的C碱基，一般会掺30%的PhiX文库、或者基因组文库。
- 在掺入30%的PhiX文库的条件下，一条HiSeq 2000 V3 PE100的Lane，大概可以得到20G 左右的甲基化文库数据。
- 也就是说，在HiSeq 2000或者2500平台上，甲基化文库的测序数据产量，一直都不是很高。质量也比较低。
5. 羟甲基化测序
DNA羟甲基化，会参与去甲基化工程，在肿瘤中表达显著降低
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- 接下来，我们说一下区分“羟”甲基化和甲基化的测序方法。
- 在用单纯的亚硫酸氢盐法来测的过程当中，甲基化和差甲化的C碱基都不能被转化成U碱基，所以单纯的亚硫酸氢盐法是无法区分甲基化或羟甲基化的C碱基的。
- 为了区分甲基化和羟甲基化，科学家想出了两种办法。
- 第一种办法，是通过高钌酸钾（KRuO4）来氧化羟甲基化的C。羟甲基化的C可以被转化成甲酰化的C碱基，而甲酰化的C碱基，是可以被亚硫酸氢盐转化成U的。
- 而甲基化的C，不会被转化成U。这样就把原来的羟甲基化的C和甲基化的C给区分开来了。
- 经研究表明，用高钌酸钾氧化的方法来氧化羟甲基化的C，其转化效率是94%左右。也就是说，每100个羟甲基化的C中，有94个会被高钌酸钾转化成甲酰化的C。并进一步被亚硫酸氢盐转化成U。
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同时，原来的甲基货摊C，只有2.1%会被转化成甲酰化的C。
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- 第二钟区分羟甲基化C的方法，是用糖基把羟甲基化的C给保护起来。然后用TET蛋白（Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 1），把甲基化的C转化成羟基化的C。
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进一步将羟甲基化的C转化成甲酰化的C和羧基化的C。甲酰化的C和羧基化的C都可以被亚硫酸氢盐转化成U。
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- 而之前被糖基化保护起来的羟甲基化的C，是不会被TET蛋白转化成甲酰化的C或者羧基化的C的。在亚硫酸氢盐的处理过程中，它还保持是C。并且在之后的PCR扩增产物中，也表现为C。
- 这样，就可以把羟甲基化的C，和甲基化的C，给区分开来。
- 用这个方法，没有甲基化的C，99.6%都被转化成了U。甲基化的C，97.7%都被转化成了U。而羟甲基化的C，只有8%被化成了U。
- 也就是说92%的羟甲基化的C得到了糖基的保护，还保持了C。
- 上述，就是目前2个区分羟甲基化的C和甲基化C的方法。
