环境微生物测序采样指南
随着高通量测序技术飞速发展，人们对微生物的认知也在逐渐深入。凌恩生物每天都会接到全国各类型微生物测序样本，上到山巅土壤，下至深海底泥；有老师研究植物根际和叶内微生物，也有老师关注动物昆虫肠道生理代谢的奥秘。为了得到能够研究的测序结果，规范标准的取样及送样是成功的前提。
在样本送测前，我们要注意以下几点：
1、取样使用的工具及容器必须经过灭菌处理；
2、取样后及时做好标记，记录取样相关信息；
3、样本送测前做好备份，防止意外发生丢失珍贵样本；
4、送测样本使用标准容器承装，在容器上标记清晰，送样不宜过多；
5、寄送时保持低温环境，建议使用干冰配送；
6、可使用凌恩微生态样本保真液，高品质样本是决定高品质研究成果的第一步。
常规土壤类样本取样方法-农田/森林/草原土壤等
(1) 取样方法
按实验设计确定采样范围，取样器具需事先消毒灭菌处理。采样时应去除地表杂质，根据需要挖取相应深度（如5~20 cm）的土壤，置于冰上运至实验室。去除可见杂质，建议过2 mm无菌筛网。同一样方多点样本等量混合均匀后取5~10 g，保存无菌EP管中，进行核酸提取，或-80℃保存备用。若不能自行提取，可置于干冰寄送至公司。
注：建议戴一次性手套、口罩，进行严格取样和操作，尽可能减少人为的污染。
根际土壤样本取样方法-作物/蔬菜/草木根系等
（1）作物类（含草地等矮小植物）根际土壤取样方法
a. 采集植物植株，去除根部大块土壤，置于冰上运输至实验室；
b. 晃动根部，去除根部松散的土壤后，使用无菌刷子从根部收集残留土壤；
c. 同一样方多点取样土壤样本等量混合均匀后，液氮速冻，置于-80℃冰箱保存。
（2）林木类根际土壤取样方法
a. 采集地面下 10-20 cm 根际土壤，置于冰上运输至实验室；
b. 过 2-5 mm 孔径无菌筛网；
c. 同一样方多点取样土壤样本等量混合均匀后，液氮速冻，置于-80℃冰箱保存。
若不能自行提取，可置于干冰寄送至公司提取。
注：取样器具请事先消毒灭菌处理。若为真菌根际土壤，请务必尽可能去除菌丝体残留，减少对 DNA/RNA 提取的干扰。
植物表面微生物取样方法
（1）取样方法
依据实验设计，进行样方设置，每一样方进行多点取样，同一样方点等量混匀成一个样本。植物根部组织可以通过摇晃振荡或无菌刷子去除根表粘附土壤。
（2）样本前处理
将植物组织浸没于无菌PBS溶液，180rpm孵育20min；取出植物组织，再次加入无菌PBS溶液，180rpm孵育20min，取出植物组织，再次加入无菌PBS溶液，超声波洗涤10min（参数：160 W，30s/30s），最后取出植物组织至于-80度冰箱保存备用。
将三次洗涤液汇总，过0.2um滤膜（或12000g离心10min，收集沉淀），收集滤膜至于-80度冰箱保存。
植物内部微生物取样方法
（1）依据实验设计，进行样方设置，每一样方进行多点取样，同一样方点等量混匀成一个样本。
（2）对植物组织进行表面消毒操作或者使用上一步“ 植物表面微生物取样”中处理过的植物组织，液氮速冻后，研磨成粉，即可用来进行核酸的提取。
植物组织表面消毒具体操作如下：
无菌水洗涤30s，70%无菌乙醇洗涤2min，2,5% NaClO（含0.1% Tween 80）浸泡5min后转移至70%无菌乙醇浸泡30s，最后使用无菌水洗涤植物组织3次，即视为对植物组织表面进行无菌化。
表面无菌化的植物组织至于-80度冰箱保存备用或进行核酸提取。
植物根表面微生物取样方法
（1）将所研究的物体放在事先灭好的无菌容器当中；
（2）加入PBS缓冲液后进行振荡，使得微生物从物体表面充分的脱落并聚集在PBS缓冲液当中,震荡至少2h以上；
（3）直接提取PBS缓冲液中的微生物或者将缓冲液用滤膜过滤之后再进行DNA的提取。
PBS浓度和PH有要求：浓度是用1x的，PH值是7.4，一般买回来的PBS是10x的，建议稀释到1x。
注意：建议优先使用超声波洗涤。
空气样本微生物取样方法
使用空气抽滤机，使空气通过 0.22 μm 滤膜，滤膜上有可见覆盖物（过滤时间越长，收集的空气中的灰尘越多，菌数量越多），收集完成后取下滤膜。滤膜置于冻存管中，液氮速冻，干冰寄送到实验室。
注意：由于样本特殊，微生物含量较少，建议多保管备份保存。
水体样本微生物取样方法
送样量：扩增子直径3-4cm滤膜1-2张；宏基因组直径3-4cm滤膜>=2张；
（1）研究目的进行确定水体的取样深度和范围；
（2）采样后进行滤膜过滤，选择合适孔径的滤膜，对于澄清水体或者略浑浊水体，选用0.22μm或者0.45μm的滤膜，取样体积大于5L；对于浑浊水体，建议先用大孔径的滤膜过滤一遍，再用小孔径的滤膜过滤；
（3）水体泥样的采集提供大于5g样本；
（4）用大体积干冰运输，且要保证我方在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余。
注意：扩增子项目将2-3L水体过滤到1-2张滤膜（0.22或0.45um）后装入到离心管中；宏基因组项目将10L水体过滤到>=2张滤膜（0.22或0.45um）后装入到离心管中。
活性污泥与水体/地表沉积物类样本取样方法
（1）活性污泥
从活性污泥装置中取大于10 ml的悬浮污泥样本（约5-10 g沉降物），保存无菌EP管中，放入液氮或置于冰上，立即运至实验室进行核酸提取，或-80℃保存备用。
注：若液态污泥样本沉降物较少，可适当增加取样量。
（2）水体/地表沉积物
取距离水底/地表0-10 cm（具体按实验需要而定）的沉积物5~10 g，保存无菌取样袋或EP管中，置于冰上运送至实验室进行核酸提取，或-80℃保存备用。若不能自行提取，可置于干冰寄送至公司提取。
