在Aging上发表的胃癌单细胞测序做了什么？

2020-03-28 本文已影响0人科研菌

欢迎关注「科研菌」

小伙伴们好呀！今天小编和大家分享的是二月份发表在Aging (IF：5.515)杂志上的一篇文章，“Single-cell RNA sequencing ofimmunecells in gastric cancer patients”，作者通过对胃癌患者癌组织和血液中免疫细胞的单细胞测序，从而对胃癌患者中各种类型的免疫细胞进行分析，为GC的免疫疗法提供理论基础。

Single-cell RNA sequencing of immune cells in gastric cancer patients

针对胃癌患者免疫细胞的单细胞测序

一. 研究背景

免疫检查点抑制剂虽然被应用于治疗一些癌症，但由于肿瘤细胞异质性，不同细胞对免疫检查点抑制剂的反应也不同，其疗效也大打折扣。近来，单细胞RNA测序已经能够在单细胞水平上对高度复杂的肿瘤微环境中的细胞群体进行特异性分析，揭示肿瘤组织中细胞的异质性。又因为还没有针对胃癌(Gastric Cancer，GC)组织的单细胞测序研究，所以本文作者从两个角度出发，即GC组织 VS 正常组织，GC患者外周血 VS 健康人外周血，通过单细胞测序尝试对不同免疫细胞的不同基因进行分析，寻找不同类型免疫细胞中的特征基因。为胃癌的免疫疗法提供理论基础。

作者主要针对CD8+ 耗竭T细胞和Treg细胞进行了多种分析为GC的免疫治疗提供理论基础。原因是CD8+ 耗竭T细胞高度表达某些抑制性分子(例如PD-1，CTLA4，LAG3和TIGIT)。这些抑制性表面分子与肿瘤细胞表面的相应配体结合，抑制CD8+ T细胞的杀伤能力，从而导致肿瘤免疫逃逸。而Treg细胞也参与到肿瘤免疫耐受中。

二. 研究思路

研究思路

三. 结果解析

1. 获取原始胃癌样本的单细胞基因表达谱并对免疫细胞聚类分析

研究的样本包括：

2 GC组织 VS 2 癌旁正常组织

3 GC患者外周血 VS 2 健康人外周血

作者依据白细胞共同抗原CD45利用流式细胞仪筛选上述样本中的免疫细胞，使用10X genomics捕获免疫单细胞后建库扩增并用HiSeq 4000 测序。使用Python中的SCANPY工具包对测序数据进行质量控制后，分别对组织和外周血中的单细胞测序数据使用UMAP法降维并可视化，在GC组织中细胞被分为10类而在外周血中细胞被分为9类，之后根据不同类细胞的特异表达基因对其进行注释。在识别了各种免疫细胞的亚型后对每种类型单独进行分析。

2. 在GC样本中的耗竭性CD8+ T细胞中IRF8低表达

图1. 转录因子IRF8与GC中的CD8+ T细胞相关

A：热图展示在GC组织和正常组织中CD8+ 耗竭T细胞中表达差异最显著前50个基因，发现GC中IRF8(干扰素调节因子8)在表达量显著下调。左侧为GC组织，右侧为癌旁正常组织

B-C：对CD8+ 耗竭T细胞中的差异基因进行通路分析，这些基因在细胞因子产生通路上富集，暗示在肿瘤微环境中CD8+ 耗竭T细胞参与细胞因子的产生

D-E：针对CD8+ T细胞的轨迹分析(Trajectory analysis)，D是针对GC组织样本，E是针对GC血液样本。

F-G：检测另外的11例GC病人中肿瘤浸润的CD8+ T细胞中IRF8表达量，与正常组织中CD8+ TIL细胞比显著下调(F)。对另外32例GC患者外周血中CD8+ T细胞中IRF8的表达量的检测(G)，并分为高表达和低表达组。作者这里用抗体和流式细胞仪筛选CD8+ T细胞，用qRT-PCR检测IRF表达量

H：利用TCGA中胃癌病人生存数据，对IRF8高低表达组做生存分析，IRF8的低表达预示着更差的预后

I：Open Targets软件显示IRF8对免疫系统中的细胞起负调控作用

3. 鉴定与GC中Treg功能唯一相关的基因

图2.鉴定与GC中Treg功能唯一相关的基因

A：热图展示在GC组织和正常组织的Treg细胞中有表达差异最显著的前50个基因

B-C：对Treg细胞中的差异基因进行通路分析，这些基因在细胞因子受体相互识别，PI3K-AKT等通路上富集

D：对GC组织中的Treg细胞进行轨迹分析，组织中存在更多的是初始T细胞(naive T，红色点)

E：对一些差异表达基因的表达量进行分析，蓝色表示GC组织，红色表示正常组织。其中转录因子RBPJ在GC组织中的Treg细胞中高表达

F：用STRING数据库建立RBPJ的PPI网络，发现其参与NOTCH通路

G：使用CancerSEA数据库对GC中Treg细胞RBPJ基因的功能进行分析，RBPJ可能主要通过调节DNA修复，转移和缺氧来抑制癌症进展

H：使用Cistrome DB Toolkit数据库查询与RBPJ相关的转录因子，并展示前20个在GC中差异表达的转录因子

I：在GEPIA数据库中分析GC中RBPJ与LAG3的表达相关性

4. B细胞的基因标记及其在GC中的通路分析

图3.B细胞的基因标记和通路分析

A-C：热图展示在GC组织和正常组织的B细胞中差异表达最显著的50个基因并进行通路分析

E：用热图展示组织样本中一些功能分子的表达情况，细胞因子中的IL8在GC组织的B细胞中高表达

B-D：热图展示在GC外周血和健康人外周血的B细胞中差异表达最显著的50个基因并进行通路分析

F：用热图展示组织样本中一些功能分子的表达情况，B细胞的活化受体CD40在GC患者外周血B细胞中低表达

5. GC中NK细胞分泌更多的抑制性受体和较少的活化受体

图4. GC中NK细胞分泌更多的抑制受体和更少的活化受体

此处作者的研究方法与结果三一致，故只对结果简要总结：

在GC组织或外周血的NK细胞中差异表达的基因可能参与了细胞因子-细胞因子受体相互作用，MAPK信号传导，趋化因子信号，和T细胞受体信号传导通路

NK细胞在GC组织中表达更多的抑制性受体，例如KIR2DL2(E)；NK细胞在GC患者血液中表达的活化受体如KLRK1和CD226更少(F)

作者除了对上述免疫细胞进行分析外还对树突状细胞，巨噬细胞等免疫细胞进行了类似结果3和结果4的分析，这里不再赘述。最后我们来总结一下这篇文章吧，作者借助单细胞测序这个手段对GC组织，GC患者外周血的免疫细胞以及对照组免疫细胞进行测序，使用UMAP法降维可视化后，根据特异表达基因将细胞注释为特定的免疫细胞。之后针对不同的免疫细胞进行差异基因的分析，功能通路分析以及特定基因的分析，这之中利用了CancerSEA，STRING，Cistrome DB Toolkit，GEPIA2等数据库辅助分析。文章思路清晰，并不复杂，我们研究时也可以根据各自领域的疾病表型，针对疾病组织中某种大类的细胞进行单细胞测序再分型，分别研究各个亚类细胞的基因表达情况。

还是和往常一样，后台回复「35a」，即可获取今天小编为大家解读的文献。本期的分享就到这里啦，一起期待下一期的精彩分享吧~

往期热门文章推荐

1. 如何筛出一篇5分文章的核心基因；

2. 筛到5分的核心基因以后你可以怎么做？

3. 干湿结合的miRNA调控网络发7+也不难；

4. 5+单基因在黑色素瘤亚型预后差异；

5. 生信杂志1|被“灌水”的Aging(IF=5.515)还能不能投？

6. 生信杂志2|推荐一本生信友好并且最快1月接受的5+分杂志

7. 生信杂志3|年刊量3000篇预计5+分的JCP

8. 生信杂志4|即将突破5分的Frontiers in Oncology是灌水杂志吗？

9. 生信杂志5|博士毕业神器3+分纯生信杂志：平均一审只要一个月，年刊量1000+

10. 生信杂志6|马上4分年刊近2000的杂志JCB：对纯生信友好还不要版面费！