单细胞Seurat包升级之2,700 PBMCs分析（下）

刘小泽写于19.8.19
主要介绍官方教程PBMC 3K的下游分析（https://satijalab.org/seurat/v3.0/pbmc3k_tutorial.html）
上篇：单细胞Seurat包升级之2,700 PBMCs分析（上）

数据标准化（scale）

它的目的是实现数据的线性转换(scaling)，这也是降维处理(如PCA)之前的标准预处理。
主要利用了ScaleData函数，回忆一下，之前归一化（normalize）这里做的操作是log处理，它是对所有基因的表达量统一对待的，最后放在了一个起跑线上。但是为了真正找到差异，我们还要基于这个起跑线，考虑不同样本对表达量的影响

它做了：

• 将每个基因在所有细胞的表达量进行调整，使得每个基因在所有细胞的表达量均值为0
• 将每个基因的表达量进行标准化，让每个基因在所有细胞中的表达量方差为1

# 先使用全部基因
all.genes <- rownames(pbmc)
> length(all.genes)
[1] 13714
pbmc <- ScaleData(pbmc, features = all.genes)
# 结果存储在pbmc[["RNA"]]@scale.data中

感觉这一步太慢，能不能加速一点？

这一步主要目的就是下一步的降维，使用全部基因是比较慢。如果想提高速度，可以只对鉴定的HVGs（之前FindVariableFeatures设置的是2000个）进行操作，其实这个函数默认就是对部分差异基因进行操作，：pbmc <- ScaleData(pbmc) 。这样操作的结果中降维和聚类不会被影响，但是只对HVGs基因进行标准化，下面画的热图依然会受到全部基因中某些极值的影响。所以为了热图的结果，还是对所有基因进行标准化比较好。

ScaleData的操作过程是怎样的?

看一下帮助文档就能了解：
ScaleData这个函数有两个默认参数：do.scale = TRUE和do.center = TRUE，然后需要输入进行scale/center的基因名（默认是取前面FindVariableFeatures的结果）。
scale和center这两个默认参数应该不陌生了，center就是对每个基因在不同细胞的表达量都减去均值；
scale就是对每个进行center后的值再除以标准差（就是进行了一个z-score的操作）

再看一个来自BioStar的讨论：https://www.biostars.org/p/349824/

问题1：为什么在NormalizeData()之后，还需要进行ScaleData操作？

前面NormalizeData进行的归一化主要考虑了测序深度/文库大小的影响（reads *10000 divide by total reads, and then log），但实际上归一化的结果还是存在基因表达量分布区间不同的问题；而ScaleData做的就是在归一化的基础上再添zero-centres （mean/sd =》 z-score），将各个表达量放在了同一个范围中，真正实现了”表达量的同一起跑线“。

另外，新版的ScaleData函数还支持设定回归参数，如（nUMI、percent.mito），来校正一些技术噪音

问题2： FindVariableGenes() or RunPCA() or FindCluster()这些参数是基于归一化Normalized_Data还是标准化Scaled_Data ？

所有操作都是基于标准化的数据Scaled_Data ，因为这个数据是针对基因间比较的。例如有两组基因表达量如下:

g1 10 20 30 40 50
g2 20 40 60 80 100

虽然它们看起来是g2的表达量是g1的两倍，但真要降维聚类时，就要看scale的结果：

> scale(c(10,20,30,40,50))
           [,1]
[1,] -1.2649111
[2,] -0.6324555
[3,]  0.0000000
[4,]  0.6324555
[5,]  1.2649111
attr(,"scaled:center")
[1] 30
attr(,"scaled:scale")
[1] 15.81139
> scale(c(20,40,60,80,100))
           [,1]
[1,] -1.2649111
[2,] -0.6324555
[3,]  0.0000000
[4,]  0.6324555
[5,]  1.2649111
attr(,"scaled:center")
[1] 60
attr(,"scaled:scale")
[1] 31.62278

二者标准化后的分布形态是一样的（只是中位数不同），而我们后来聚类也是看数据的分布，分布相似聚在一起。所以归一化差两倍的两个基因，根据标准化的结果依然聚在了一起

问题3： ScaleData()在scRNA分析中一定要用吗？

实际上标准化这个过程不是单细胞分析固有的，在很多机器学习、降维算法中比较不同feature的距离时经常使用。当不进行标准化时，有时feature之间巨大的差异（就像👆问题2中差两倍的基因表达量，实际上可能差的倍数会更多）会影响分析结果，让我们误以为它们的数据分布相差很远。

很多时候，我们会混淆normalization和scale：那么看一句英文解释：

Normalization "normalizes" within the cell for the difference in sequenicng depth / mRNA throughput. 主要着眼于样本的文库大小差异
Scaling "normalizes" across the sample for differences in range of variation of expression of genes . 主要着眼于基因的表达分布差异

另外，看scale()函数的帮助文档就会发现，它实际上是对列进行操作：

那么具体操作中是要先对表达矩阵转置，然后scale，最后转回来

t(scale(t(dat[genes,])))

问题4：RunCCA()函数需要归一化数据还是标准化数据？

通过看这个函数的帮助文档：

RunCCA(object, object2, group1, group2, group.by, num.cc = 20, genes.use,
  scale.data = TRUE, rescale.groups = FALSE, ...)

显示scale.data = TRUE，那么就需要标准化后的数据

怎样移除不想要的差异来源？

在进行降维聚类时，主要就是考虑数据差异对分布产生的影响。由于技术误差导致的差异是我们不感兴趣的，排除这一部分其实也在上面的问题1中提到了，如果说不想线粒体污染导致的差异影响整体差异分布：

pbmc <- ScaleData(pbmc, vars.to.regress = "percent.mt")

这个函数仅针对初级用户，如果想深入探索技术误差的排除，官方给出了另一个专业版函数：SCTransform，它也包含vars.to.regress这个选项。详细的说明在：https://satijalab.org/seurat/v3.0/sctransform_vignette.html

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进行线性降维

最常用的线性降维就是PCA方法，使用标准化的数据

它默认选择之前鉴定的差异基因（2000个）作为input，但可以使用features进行设置；默认分析的主成分数量是50个

# 这里就使用默认值
pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc))
# 结果保存在reductions 这个接口中

检查下PCA结果：

> print(pbmc[["pca"]], dims = 1:3, nfeatures = 5)
# 或者用 print(pbmc@reductions$pca, dims = 1:3, nfeatures = 5)
PC_ 1 
Positive:  CST3, TYROBP, LST1, AIF1, FTL 
Negative:  MALAT1, LTB, IL32, IL7R, CD2 
PC_ 2 
Positive:  CD79A, MS4A1, TCL1A, HLA-DQA1, HLA-DQB1 
Negative:  NKG7, PRF1, CST7, GZMB, GZMA 
PC_ 3 
Positive:  HLA-DQA1, CD79A, CD79B, HLA-DQB1, HLA-DPB1 
Negative:  PPBP, PF4, SDPR, SPARC, GNG11 

用VizDimLoadings对print的结果可视化：

VizDimLoadings(pbmc, dims = 1:3, reduction = "pca")

对print的结果可视化

用DimPlot进行降维后的可视化

提取两个主成分（默认前两个，当然可以修改dims选项）绘制散点图

DimPlot(pbmc, reduction = "pca")

这个图中每个点就是一个样本，它根据PCA的结果坐标进行画图，这个坐标保存在了cell.embeddings中：

> head(pbmc[['pca']]@cell.embeddings)[1:2,1:2]
                     PC_1       PC_2
AAACATACAACCAC -4.7296855 -0.5184265
AAACATTGAGCTAC -0.5174029  4.5918957

其实还支持定义分组：根据pbmc@meta.data中的ident分组：

> table(pbmc@meta.data$orig.ident)

pbmc3k 
  2638 
# 当然这里只有一个分组

探索异质性来源—DimHeatmap

每个细胞和基因都根据PCA结果得分进行了排序，默认画前30个基因（nfeatures设置），1个主成分(dims设置)，细胞数没有默认值（cells设置）

DimHeatmap(pbmc, dims = 1:15, cells = 500, balanced = TRUE)
# 其中balanced表示正负得分的基因各占一半

降维的真实目的是尽可能减少具有相关性的变量数目，例如原来有700个样本，也就是700个维度/变量，但实际上根据样本中的基因表达量来归类，它们或多或少都会有一些关联，这样有关联的一些样本就会聚成一小撮，表示它们的”特征距离“相近。最后直接分析这些”小撮“，就用最少的变量代表了实际最多的特征

既然每个主成分都表示具有相关性的一小撮变量（称之为”metafeature“，元特征集），那么问题来了：

降维后怎么选择合适数量的主成分来代表整个数据集？

选10个？20个？50个？最简单的方法就是：

ElbowPlot(pbmc)

它是根据每个主成分对总体变异水平的贡献百分比排序得到的图，我们主要关注”肘部“的PC，它是一个转折点（也即是这里的PC9-10），说明取前10个主成分可以比较好地代表总体变化

但官方依然建议我们，下游分析时多用几个成分试试（10个、15个甚至50个），如果起初选择的合适，结果不会有太大变化；另外推荐开始不确定时要多选一些主成分，也不要直接就定下5个成分进行后续分析，那样很有可能会出错

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细胞聚类

Seurat 3版本提供了graph-based 聚类算法，参考两篇文章：SNN-Cliq, Xu and Su, Bioinformatics, 2015] 和 PhenoGraph, Levine et al., Cell, 2015]. 简言之，这些graph的方法都是将细胞嵌入一个算法图层中，例如：K-nearest neighbor (KNN) graph 中，每个细胞之间的连线就表示相似的基因表达模式，然后按照这个相似性将图分隔成一个个的高度相关的小群体（名叫‘quasi-cliques’ or ‘communities’）；

KNN解释（https://slideplayer.com/slide/7087250/）

又比如，在PhenoGraph中，首先根据PCA的欧氏距离结果，构建了KNN图，找到了各个近邻组成的小社区；然后根据近邻中两两住户（细胞）之间的交往次数（shared overlap）计算每条线的权重（术语叫Jaccard similarity） 。这些计算都是用包装好的函数FindNeighbors() 得到的，它的输入就是前面降维最终确定的主成分

# 因为我们前面挑选了10个PCs，所以这里dims定义为10个
pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:10)

以上是凭个人理解发挥，大概就是这么个意思，不涉及算法层面推导

得到权重后，为了对细胞进行聚类，使用了计算模块的算法（默认使用Louvain，另外还有包括SLM的其他三种），使用FindClusters() 进行聚类。其中包含了一个resolution的选项，它会设置一个”间隔“值，该值越大，间隔越大，得到的cluster数量越多

怎么理解这个resolution参数？
可以想象成配眼镜的时候，镜片度数越高，分辨率越高，看的越清楚，看到的细节越丰富（cluster越多）；反之，如果分辨率调的很低，结果就看的模模糊糊一大坨

一般来说，这个值在细胞数量为3000左右时设为0.4-1.2 会有比较好的结果

pbmc <- FindClusters(pbmc, resolution = 0.5)
# 结果聚成几类，用Idents查看
> head(Idents(pbmc), 5)
AAACATACAACCAC AAACATTGAGCTAC AAACATTGATCAGC AAACCGTGCTTCCG 
             1              3              1              2 
AAACCGTGTATGCG 
             6 
Levels: 0 1 2 3 4 5 6 7 8
# 发现3000细胞，设resolution=0.5时，得到Number of communities: 9

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另一种降维方法—非线性降维（UMAP/tSNE）

线性降维PCA（1933）一个特点就是：它将高维中不相似的数据点放在较低维度时，会尽可能多地保留原始数据的差异，因此导致这些不相似的数据相距甚远，大多的数据重叠放置
tSNE（2008）兼顾了高维降维+低维展示，降维后的那些不相似的数据点依然可以放得靠近一些，保证了点既在局部分散，又在全局聚集
后来开发的UMAP（2018）相比tSNE又能展示更多的维度(参考文献：https://sci-hub.tw/https://doi.org/10.1038/nbt.4314)

做个对比：

https://www.nature.com/articles/nbt.4314

# 使用UMAP
pbmc <- RunUMAP(pbmc, dims = 1:10)
DimPlot(pbmc, reduction = "umap") # 还可以设置label = TRUE让数字显示在每个cluster上

# 对计算过程很费时的结果保存一下
save(pbmc, file = 'pbmc_umap.Rdata')

需要注意的点：

注意1：tSNE算法具有随机性，为了保证重复性，要固定一个随机种子

注意2：如何在R中使用UMAP？

以下测试是在个人电脑上，需要管理员权限

因为UMAP是基于Python的，如果要用它，必须先保证有一个python的安装环境，先试验一下：

> reticulate::py_install(packages ='umap-learn')
# 结果报错，说让我升级一下virtualenv(mac和linux默认使用virtualenv，而Windows只能使用conda)
Error: Prerequisites for installing Python packages not available.

Execute the following at a terminal to install the prerequisites:

$ sudo /usr/local/bin/pip install --upgrade virtualenv

然后直接在Rstudio中打开Terminal，输入：sudo /usr/local/bin/pip install --upgrade virtualenv

再运行一遍上面的R代码（成功与否取决于个人的网络，因为它要通过外链去下载，wlan有限制的话就用个人热点吧）：

一般总共二三十兆的文件，需要下载个十几分钟，速度确实很慢，而这个过程很有可能出现断线，只能重新运行安装。已下载完的文件会直接识别不会重复下载。检查是否下载成功标志就是：library(umap)能否成功，这个是Seurat调用的基础。最后特别注意，要重启一下Rstudio再运行RunUMAP

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找差异表达基因（cluster biomarker）

目的是根据表达量不同这个特征而分出不同细胞群的基因们（就是找具有生物学意义的HVGs=》即biomarkers）
marker可以理解成标记，就是一看到有这些基因，就说明是这个细胞群体

主要利用FindAllMarkers()函数，它默认会对单独的一个细胞群与其他几群细胞进行比较找到正、负表达biomarker（这里的正负有点上调、下调基因的意思；正marker表示在我这个cluster中表达量高，而在其他的cluster中低）

# 找到cluster1中的marker基因
cluster1.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 1, min.pct = 0.25)
head(cluster1.markers, n = 5)

上面这个代码中min.pct的意思是：一个基因在任何两群细胞中的占比最低不能低于多少，当然这个可以设为0，但会大大加大计算量

另外，如果要比较cluster5和cluster0、cluster3的marker基因：

cluster5.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 5, ident.2 = c(0, 3), min.pct = 0.25)
head(cluster5.markers, n = 5)

一步到位的办法FindAllMarkers（对所有cluster都比较一下，并只挑出来正表达marker）：

pbmc.markers <- FindAllMarkers(pbmc, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25)
# 这一步过滤好好理解(进行了分类、排序、挑前2个)
pbmc.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 2, wt = avg_logFC)

Seurat提供了多种差异分析的检验方法，在test.use选项中设置（详见：DE vignette ）例如：

cluster1.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 0, logfc.threshold = 0.25, test.use = "roc", only.pos = TRUE)

多种可视化方法：

• VlnPlot：用小提琴图对某些基因在全部cluster中表达量进行绘制

  VlnPlot(pbmc, features = c("MS4A1", "CD79A"))
  

  

• FeaturePlot：最常用的可视化=》将基因表达量投射到降维聚类结果中

  FeaturePlot(pbmc, features = c("MS4A1", "GNLY", "CD3E", "CD14", "FCER1A", "FCGR3A", "LYZ", "PPBP", "CD8A"))
  

  

另外还有：RidgePlot, CellScatter, and DotPlot

• DoHeatmap 对给定细胞和基因绘制热图，例如对每个cluster绘制前20个marker

  top10 <- pbmc.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 10, wt = avg_logFC)
  DoHeatmap(pbmc, features = top10$gene) + NoLegend()
  

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赋予每个cluster细胞类型

重点在于背景知识的理解，能够将marker与细胞类型对应起来，例如这里从各个cluster中找到的marker对应到了不同的细胞（这一过程是比较考验课题理解程度的）：

有了这个，绘图就很简单：

new.cluster.ids <- c("Naive CD4 T", "Memory CD4 T", "CD14+ Mono", "B", "CD8 T", "FCGR3A+ Mono", "NK", "DC", "Platelet")
names(new.cluster.ids) <- levels(pbmc)
pbmc <- RenameIdents(pbmc, new.cluster.ids)
DimPlot(pbmc, reduction = "umap", label = TRUE, pt.size = 0.5) + NoLegend()

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