CHIP-Seq(4):把bam文件转为bw文件，使用deept

2022-03-23 本文已影响0人 Li_bioinfo

BAM文件是SAM的二进制转换版，bigWig是wig或bedGraph的二进制版，存放区间的坐标轴信息和相关计分(score)，主要用于在基因组浏览器上查看数据的连续密度图，可用wigToBigWig从wiggle进行转换。

为什么要用bigWig? 主要是因为BAM文件比较大，直接用于展示时对服务器要求较大。因此在GEO上仅会提供bw,即bigWig下载，便于下载和查看。得到的bw文件就可以送去IGV/Jbrowse进行可视化。

deeptools提供bamCoverage和bamCompare进行格式转换。

为了能够比较不同的样本，需要对先将基因组分成等宽分箱(bin)，统计每个分箱的read数，最后得到描述性统计值。

bamCoverage对于单个样本，可以用SES方法进行标准化。

bamCompare 对于两个样本，描述性统计值可以是两个样本的比率，或是比率的log2值，或者是差值。

1.将bam文件转为bw文件

将未去重的bam 文件转为bw
mkdir bw#创建用来存放bw文件的文件夹
cat > bam2bw.sh
ls *.bam |while read id;do
bamCoverage -p 10 --normalizeUsing CPM -b $id -o ${id%%.*}.bw
done 
nohup sh bam2bw.sh > bam2bw.log 2>&1 &
mv *.bw bw
mv bw ../
将去重的bam 文件转为bw
mkdir rmdup.bw#创建用来存放bw文件的文件夹
cat > bam2bw.rmdup.sh
ls *.rmdup.bam |while read id;
do
bamCoverage -p 10 --normalizeUsing CPM -b $id -o ${id%%.*}.rmdup.bw
done 
nohup sh bam2bw.rmdup.sh > bam2bw.rmdup.log 2>&1 &
mv *.rmdup.bw rmdup.bw
mv rmdup.bw ../

2.载入IGV进行查看

查看bam文件和bw文件
找一个样本WT_rep1_BAF155.bam （未去重）和WT_rep1_BAF155.rmdup.rmdup.bam（去除PCR重复后）导入IGV中进行查看去除PCR重复前后的变化：可以看到这个样本没有去除重复前有很多PCR重复。因为这些片段都是经过PCR重复扩增而来的，所以是一模一样的。因为都是一条母链复制而来的。
可以看到在rmdup后，bam文件上变化挺大的，但是bw文件却相差不大。

image.png

3.查看TSS附件信号强度

1.背景知识

image.png

启动子（promoter）：与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。

转录起始点（TSS）：转录时，mRNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，通常为一个嘌呤。

UTR（Untranslated Regions)：即非翻译区，是信使RNA（mRNA）分子两端的非编码片段。

5'-UTR从mRNA起点的甲基化鸟嘌呤核苷酸帽延伸至AUG起始密码子，3'-UTR从编码区末端的终止密码子延伸至多聚A尾巴（Poly-A）的末端。

2.下载TSS.bed文件：参考这篇教程，https://www.jianshu.com/p/d6cb795af22a

3.在tss前后2kb的位置批量画图

### 在tss前后2kb的位置画图
bed=/home/zhangyihui/my_data/ref_data/hg19/hg19.bed
for id in *bw;
do
file=$(basename $id )
sample=${file%%.*}
echo $sample
computeMatrix reference-point  --referencePoint TSS  -p 15  \
-b 2000 -a 2000    \
-R  $bed \
-S $id  \
--skipZeros  -o matrix1_${sample}_TSS_2K.gz  \
--outFileSortedRegions regions1_${sample}_TSS_2K.bed

###  both plotHeatmap and plotProfile will use the output from   computeMatrix
plotHeatmap -m matrix1_${sample}_TSS_2K.gz  -out ${sample}_Heatmap_2K.png
plotHeatmap -m matrix1_${sample}_TSS_2K.gz  -out ${sample}_Heatmap_2K.pdf --plotFileFormat pdf  --dpi 720  
plotProfile -m matrix1_${sample}_TSS_2K.gz  -out ${sample}_Profile_2K.png
plotProfile -m matrix1_${sample}_TSS_2K.gz  -out ${sample}_Profile_2K.pdf --plotFileFormat pdf --perGroup --dpi 720 
done 


#computeMatrix reference-point函数的参数
#--referencePoint {TSS,TES,center}    The reference point for the plotting could be either the region start (TSS), the region end (TES) or the center of the region
#-b/--beforeRegionStartLength INT bp：区域前多少bp
#-a/--afterRegionStartLength INT bp：区域后多少bp
#-R/--regionsFileName File：指定bed文件
#-S/--scoreFileName File：指定bw文件
#--skipZeros：默认为False
#-o/-out/--outFileName OUTFILENAME：指定输出文件名
#--outFileSortedRegions BED file

#plotHeatmap和plotProfile函数参数
#-m/--matrixFile MATRIXFILE：指定matrix名字（computeMatrix的输出文件名）
#-o/-out/--outFileName OUTFILENAME：指定输出文件名，根据后缀自动决定图像的格式
#--plotFileFormat {"png", "eps", "pdf", "plotly"，"svg"}：指定输出文件格式
#--dpi DPI：指定dpi
#--perGroup：默认是画一个样本的所有区域群的图，使用这个选项后则按区域群画所有样本的情况