超级详细的ka、ks分析
1 文件准备
首先准备两个文件，一个是基因的cds序列，一个是蛋白质序列。
cds序列和蛋白质可以在ensembl网站找到：http://ftp.ensembl.org/pub/current_fasta/
这两个文件的示例如下：
cds序列文件cds.fa
>gene1
ATGGAGGTTGCAATGGTGAGTGCGGAGAGCTCAGGATGCAACAGTCACATGCCTTACGGT
TATGCTGCCCAGGCCCGGGCCCGGGAGCGGGAGAGGCTTGCTCACTCCAGGGCAGCTGCG
GCAGCTGCCGTTGCAGCGGCCACAGCTGCCGTCGAAGGAAGTGGGGGTTCTGGTGGGGGG
>gene2
ATGGAGGTTGCAATGGTGAGTGCGGAGAGCTCAGGGTGCAACAGTCACATGCCTTATGGT
TATGCTGCCCAGGCCCGGGCCCGGGAGCGGGAGAGGCTTGCTCACTCCAGGGCAGCTGCA
GCAGCTGCTGTTGCAGCGGCCACAGCTGCTGTCGAAGGTAGCGGGGGTTCTGGTGGGGGC
TCCCAC
>gene3
ATGGAGGTGGCGATGGTGAGTGCGGAGAGCTCAGGGTGCAACAGTCACATGCCTTACGGG
TACGCGGCCCAGGCCCGGGCCCGGGAGCGGGAGAGGCTGGCTCACTCCCGGGCGGCGGCG
GCCGCCGCCGTCGCGGCTGCCACGGCTGCCGTGGAAGGCAGTGGGGGGCCTGG
蛋白质序列pep.fa
>gene1
MEVAMVSAESSGCNSHMPYGYAAQARARERERLAHSRAAAAAAVAAATAAVEGSGGSGGG
>gene2
MEVAMVSAESSRCNSHMPYGYAAQARARERERLAHSRAAAAAAVAAATAAVEGSGSSGGGSH
>gene3
MEVAMVSAESSGCNSHMPYGYAAQARARERERLAHSRAAAAAAVAAAKAAVEGSGGP
注意：cds.fa和pep.fa文件的序列ID号（gene1,2,3）要一致。
2 对蛋白质序列pep.fa进行比对
进行蛋白质序列比对前，需要先安装mafft软件。
下载mafft软件：
wget https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/mafft-7.453-with-extensions-src.tgz
tar -zxvf mafft-7.453-with-extensions-src.tgz
cd mafft-7.453-with-extensions/core
安装：
1）有root权限用户安装法：
make clean
make
su
make install
2）无root权限用户安装法：
vi Makefile
进入makefile文件后，修改第一行和第三行，如下所示两张图，分别为修改前和修改后（请务必修改你有权限的路径）：
图片.png
图片.png
安装成功后，输入命令
mafft --auto pep.fa > alig_pep.fa
生成的alig_pep.fa文件如下
图片.png
3 将比对好的蛋白质序列与cds序列比对
这一步需要下载pal2nal.pl文件
wget http://www.bork.embl.de/pal2nal/distribution/pal2nal.v14.tar.gz
tar -zxvf pal2nal.v14.tar.gz
cd pal2nal.v14/
下载后就能看见pal2nal.pl这个文件
随后将蛋白质序列与cds序列比对
pal2nal.pl alig_pep.fa cds.fa -output fasta > cds_pep_aln.fa
比对好的cds_pep_aln.fa文件如下所示：
图片.png
4 生成计算kaks值时的基因对
计算kaks值前需要先将cds_pep_aln.fa文件拆分：
csplit cds_pep_aln.fa /\>/ -n2 -s {*} -f gene -b "%1d.fa" ; rm gene0.fa
拆分后，会生成gene1.fa 、gene2.fa、 gene3.fa三个文件。
接下来，将生成的gene1.fa、 gene2.fa、 gene3.fa组成新的基因对gene1-gene2、gene1-gene3、gene2-gene3，见如下命令：
for i in $(seq 1 3)
do
cat gene1.fa gene${i}.fa > gene1_${i}.fa
done
cat gene2.fa gene3.fa > gene2_3.fa
生成如下几个文件：
gene1_1.fa
gene1_2.fa
gene1_3.fa
gene2_3.fa
其中，gene1_2.fa、gene1_3.fa、gene2_3.fa为我们所需的基因对。
这里将他们提取成基因对，而不是多条序列进行计算的原因是，
KaKs_Calculator这个软件在处理多序列的输入文件时，会报错：Error. The size of two sequences in 'gene1&gene2' is not equal。我尝试了很多遍，发现只能提取成基因对才不会报这种错误。当然，偶尔运气好的时候，KaKs_Calculator是能处理多序列的kaks值的，为了防止出错，我们还是将他们拆开计算好一点。
5 将gene1_2.fa、gene1_3.fa、gene2_3.fa文件转化为axt文件
转化为axt文件需要下载parseFastaIntoAXT.pl文件，文件地址：https://gitee.com/liaochenlanruo/kaks_pupline/blob/master/parseFastaIntoAXT.pl
下载后，输入如下命令:
for i in *.fa
do
echo $i
perl parseFastaIntoAXT.pl $i
done
生成三个文件：
gene1_2.fa.axt
gene1_3.fa.axt
gene2_3.fa.axt
6 计算ka/ks值
下载安装kakscalculator
下载链接：https://sourceforge.net/projects/kakscalculator2/
输入以下命令：
for i in *.fa.axt
do
echo $i
KaKs_Calculator -i $i -o ${i%%.*}.kaks
done
生成三个文件：gene1_2.kaks、gene1_3.kaks、gene2_3.kaks
到这一步，批量计算kaks值的工作就已经搞定。
这里附上安装
kaks_calculator软件可能会遇到报错：
g++ -O -o AXTConvertor AXTConvertor.cpp -lstdc++ -lm
AXTConvertor.cpp: In function ?.ool readPhylip()?.
AXTConvertor.cpp:210:22: error: ?.toi?.was not declared in this scope
if (atoi(num.c_str())!=sequence.size()){AXTConvertor.cpp: In function ?.ool readNexus()?.
AXTConvertor.cpp:338:39: error: ?.toi?.was not declared in this scope
if (sequence.size()!=atoi(num.c_str())) >{
make: *** [AXTConvertor] Error 1
解决方法在这里：
编辑KaKs.cpp文件，加上
include "string.h"
编辑AXTConvertor.cpp文件，加上
include "stdlib.h"
编辑GY94.cpp文件，加上
include "string.h"如无报错请忽略上述内容。
