RNAseq终极篇章qPCR
RNAseq对于生信达人来说已经烂熟了，但是相信好多人分析做好了，最后验证却验证不出来，愁的不行！呵呵，今天好了，小编给你一弹，做好验证工作的基本功-荧光定量PCR介绍。
一、实时荧光定量PCR简介
聚合酶链式反应(PCR)是分子生物学领域功能最强大的技术之一,在实时荧光定量PCR中，每次循环结束后通过荧光染料检测DNA的量，荧光染料产生的荧光信号与生成的PCR产物分子(扩增片段)数直接成正比。利用反应指数期采集的荧光数据，生成有关扩增靶点起始量的定量信息。在理论上，PCR可呈指数型扩增DNA，使每个扩增循环中的靶分子数量倍增。实时荧光定量PCR使用的荧光报告基团包括双链DNA (dsDNA)结合染料或在扩增过程中掺入PCR反应，与PCR引物或探针结合的染料分子。利用具有热循环功能及荧光染料筛查能力的仪器，检测反应过程中荧光的变化。实时荧光定量PCR仪通过绘制荧光与循环数曲线，生成扩增曲线，表示在整个PCR反应过程中积聚的产物。
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实时荧光定量PCR的优点：
• 能够实时监控PCR反应的进程
• 能够精确测定每个循环的扩增片段数量，从而对样本中的起始材料量进行准确定量
• 具有更大的检测动态范围
• 在单管中实现扩增和检测，无需PCR后处理
现在，实时荧光定量PCR已成为DNA或RNA检测和定量的主要工具，可以实现精确的检测，其准确度低至2倍范围，起始材料的动态范围达6至8个数量级。
二、实时荧光定量PCR检测系统及原理
实时荧光定量PCR试剂的种类很多，但最常用的是5’核 酸酶Assay，其中最为人熟知的是TaqMan® Assay和基于 SYBR® Green染料的Assay。
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5’核酸酶结构域能够在DNA合成结束后，降解与模板结合的DNA。5’核酸酶Assay的第二个关键是一种称为FRET的现象：荧光共振能量转移。在FRET中，邻位的另一种染料-通常被称为淬灭剂-可大大降低荧光染料的发射信号。
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TaqMan 探针作用机理
TaqMan水解探针：完整的探针检测不到报告荧光信号；切断的探针检测到报告荧光信号。
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TaqMan®探针具有基因特异性序列，可与两个PCR引物之间的靶点结合。TaqMan®探针的5’端带有“报告基团”，该荧光染料将报告靶点的扩增。探针的3’端为淬灭剂，它可以淬灭完整探针中报告基团发出的荧光。淬灭剂还将阻断探针的3’端，这样即无法在热稳定性DNA聚合酶作用下延伸。
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- 荧光标记组合
报告荧光: 6-FAM、JOE、VIC、NED、CY3、Texas Red、CY5
淬灭荧光: MGB-NFQ、TAMRA、BHQ
参比荧光: ROX
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常用的荧光组合：
FAM 目的基因1
VIC 目的基因2/内对照
NED 目的基因3
ROX 参比荧光
2。SYBR ® Green I 染料作用机理
SYBR®GreenI染料是一种荧光DNA结合染料，可与双链DNA的小沟结合。激发与DNA结合的SYBR®Green染料可产生较未结合染料更强的荧光信号。基于SYBR®Green染料的Assay一般包括两个PCR引物。在理想状态下，SYBR®GreenAssay的扩增图谱与基于TaqMan®探针的Assay类似。在早期PCR循环中，可观察到水平基线。如果样本中存在靶点，则在某个时间点将生成足够的PCR产物，使扩增信号变得可见。
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SYBR® Green I方法的局限性：任意双链，非特异结合→非特异产物信号→不准确结果。可以通过熔解曲线校准。
单一产物的熔解曲线：
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多个PCR产物的熔解曲线：产生原因有非特异扩增，引物二聚体等。
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评估每个可以观察到扩增的孔的熔解曲线数据。如果样本中包含的峰无法对应纯的靶点峰，则结论是反应中未检测到靶点。如果样本中包含的峰似乎与Tm值及纯靶点峰的形状匹配，则反应中可能有靶点扩增。利用单独的解离曲线无法获得确定的结果，但应与其它信息相结合(如阴性靶点样本、序列或凝胶)，则可提高特异性的可信度。
三、实时荧光定量PCR的主要参数
1. DNA 聚合酶：PCR的性能通常与热稳定性DNA聚合酶有关，因此酶的选择是反应成功的关键。影响PCR特异性的一个主要因素是Taq DNA聚合酶在低温下具有残留活性，引物可与DNA非特异性地退火结合，使得聚合酶合成非特异性产物。通过采用“热启动”酶，可最大程度地减少因引物错配形成非特异性产物的问题。采用热启动酶确保了在反应设置过程和初始DNA变性步骤中，DNA聚合酶无活性。
- 逆转录酶：逆转录酶(RT)同DNA聚合酶一样，亦是qRT-PCR成功的关键。选择一种不仅能够提供高全长 cDNA 产量且在高温下具有良好活性的RT至关重要。高温性能对于具有二级结构的RNA的变性同样极为重要。
3. dNTP：最好从同一供应商那里购买dNTP和热稳定性DNA聚合酶，因为在实验中使用不同供应商的试剂，常常会出现阈值循环(Ct)灵敏度下降的情况。
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镁离子浓度：在实时荧光定量PCR中，氯化镁或硫酸镁的终浓度一般为3mM。这是大多数靶点的最佳工作浓度；但镁离子的最佳浓度范围为3至6mM。
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模板：每次实时荧光定量PCR反应需使用10至1000拷贝的模板核酸。这相当于大约100pg至1μg的基因组DNA或利用1pg至100ng总RNA生成的cDNA。多余的模板会提高污染物含量，大大降低PCR效率。PCR引物的特异性针对cDNA而非基因组DNA，处理RNA模板以降低其包含基因组DNA污染的几率十分重要，如可以采用DNA酶I处理模板。
6．基线：实时荧光定量PCR反应的基线是指在PCR的最初几个循环中(一般为第3至15个循环)的信号水平，此阶段的荧光信号变化极小。低水平的基线信号相当于反应的背景或“噪声”。每个实时荧光定量PCR反应的基线应通过人工分析或扩增曲线自动分析，根据经验确定。应仔细设置基线，以准确确定阈值循环(Ct)。基线确定应考虑足够的循环数，消除扩增早期的背景影响，但应排除扩增信号开始超过背景的循环。当比较不同的实时荧光定量PCR反应或实验时，应采用同样的方法确定基线。
7． 阈值：实时荧光定量PCR反应的阈值信号水平较计算出的基线信号水平有显著增加。设置阈值可将相关扩增信号从背景中区分出来。实时荧光定量PCR仪软件通常将阈值自动设置为基线荧光值标准差的10倍。但阈值可设置在PCR指数期的任意点。
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8. Ct(阈值循环)：阈值循环(Ct)是反应的荧光信号与阈值交叉的循环数。Ct值可用于计算起始DNA拷贝数，因为Ct值与起始靶点量呈反比。例如，比较含有不同靶点量的样本的实时荧光定量PCR结果时，起始量两倍的样本较扩增前含有一半拷贝数的样本可提早一个循环生成Ct。假定上述两个反应的PCR的工作效率均为100%(即每个循环后产物量均实现倍增)。模板量越低，出现明显扩增的循环数越高。
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- 标准曲线:利用连续稀释的已知样本建立标准曲线，确定实验样本的目的模板起始量，或者评估反应效率。以已知的连 续稀释浓度的对数为横坐标(x轴)，该浓度对应的Ct值为纵 坐标(y轴)，绘制曲线。从该标准曲线中可以推导出反应性能及各种反应参数(包括斜率、y截距和相关系数)相关 的信息。标准曲线中所选的浓度应涵盖实验样本的预期靶点浓度范围。
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- 相关系数(R2):相关系数可用于表示数据与标准曲线之间的契合度。R2值反映了标准曲线的线性度。在理论上，R2=1，但0.999一般为最大值。
11. Y-截距:y-截距表示反应的理论最低检测限，或者x轴上的最低拷贝数的靶分子产生明显扩增时的预期Ct值。尽管PCR在理论上能够检测单拷贝靶点，但在实时荧光定量PCR应用中能可靠定量的最低靶点量通常为2–10拷贝。这限制了y-截距值直接反映灵敏度的作用。但y-截距值可用于比较不同的扩增系统和靶点。
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指数期:在指数期的早期，而不是指数期的晚期或反应达到平台时进行实时荧光定量PCR反应定量十分重要。在指数期的开始，所有试剂仍有剩余，DNA聚合酶仍然高效，扩增产物的量较少，不会竞争引物的退火性能。所有这些均可提高数据的准确度。
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斜率：扩增反应的对数线性期的斜率可用于检测反应效率。要获得准确且可重复的结果，反应效率应尽可能接近100%，相当于斜率为-3.32。
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效率：100%的PCR效率对应的斜率为-3.32，可根据下列等式确定：效率=10(-1/斜率)-1理论上，PCR反应的效率(E)应为100%，表示在指数扩增阶段每次热循环后的模板倍增。实际效率可提供反应相关的重要信息。诸如扩增片段的长度、二级结构和GC含量等实验因素会影响效率。影响效率的其它条件有反应本身的动态范围、使用的试剂浓度未达到最佳以及酶的质量，这些因素均会导致效率低于90%一种或多种试剂中存在的PCR抑制剂可使其效率超过110%。良好的反应效率应在90%至110%之间，其对应的斜率为-3.58至-3.10。
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动态范围：在此范围内，起始材料的浓度增加，扩增产物也相应增加。理论上，质粒DNA的实时荧光定量PCR的动态范围应为7-8个数量级，cDNA或基因组DNA至少为3–4log范围。
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绝对定量：绝对定量是指在实时荧光定量PCR实验中，对已知量的样本进行连续稀释后扩增，生成标准曲线。然后通过与此曲线比较，定量未知样本。
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相对定量：相对定量是指在实时荧光定量PCR实验中，将一个样本(已处理)中的目的基因表达与另一个样本(未处理)中相同基因的表达相比较。结果以处理样本的表达量相对于未处理样本表达量的倍数变化(增加或减少)表示。此类型的定量采用标准品基因(如β-actin)作为实验差异对照品。
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熔解曲线(解离曲线)：熔解曲线图示了随着反应温度的升高，当结合染料分子的双链DNA(dsDNA)解离或“熔解”成单链DNA(ssDNA)时，观察到的荧光强度的变化。例如，当加热结合有SYBR GreenI染料的双链DNA时，其达到熔点(Tm)后，由于DNA链的解离和染料的释放，检测的荧光强度会出现突然下降。绘制荧光强度与温度图，及-ΔF/ΔT(荧光变化/温度变化)与温度图，清晰显示熔解曲线动态范围。
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实时荧光定量 PCR 的引物（定量PCR最重要的因素）
一般而言，引物的长度应为18–24个寡核苷酸，这是针对实际的退火温度的。引物应根据标准PCR指南设计，对于目的基因序列应是特异性的，且无内部二级结构。引物应不含共聚物延伸段序列(如poly(dG))或重复基序，因其可引起不必要的杂交。
引物对应具有差不多的熔解温度(相差在5°C以内)，且GC含量约为50%。高GC含量的引物可形成稳定的不良杂合体。相反，高AT含量会降低匹配良好的杂合体的Tm值。如果可能，引物的3’端应具有高GC含量(GC夹)，以提升延伸端的退火效率。分析引物对序列，避免引物之间的互补和杂交(引物二聚体)。
在qRT-PCR中，设计内含子两侧可与外显子退火结合的引物(或覆盖mRNA相邻两个外显子交界处)，利用熔解曲线分析区分cDNA和潜在污染基因组DNA的扩增。要确认引物的特异性，可在公共数据库上进行BLAST搜索，以确保引物只识别目的靶点。引物设计软件程序有 LifeTechnologies 在线OligoPerfect 设计程序和 Vector NTI软件序列分析软件。
假如获得最佳结果，需要在50至500nM浓度间进行引物滴定。一般引物终浓度为200nM时能有效地进行大多数的实验。
四、参考文献
1. real-time-pcr-handbook
2.实时荧光定量 PCR 手册-中文版
