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听张旭东老师的课

发展情形

• 蛋白质组学、代谢组学技术不成熟，费用高 → 大量做转录组学(间接)
• 表达芯片已经大部分被转录组测序替代，表达芯片优劣势，有可能芯片上没有

简单的分析流程

测序数据(上百G) --标准分析(需要服务器)→ 表达矩阵(几M) --数据挖掘(PC/R语言)→ 统计图表(几M)

表达数据挖掘

• 三张表

① 表达矩阵：每行一个gene,每列一个样本sample（可以在GEO数据库下载）

g/S	Sample1	Sample2	Sample3
gene1	38	55	76
gene2	127	41	86
gene3	46	29	34
...	...	...	...

② 样本信息表：每行一个样本，每列一个表型特征（临床信息、表型特征、生化指标等）

S/Phenotype	Group	Weight	Age	Stage
Sample1	Cancer	20	10	I
Sample2	Cancer	34	39	III
Sample3	Normal	64	49	IV
Sample4	Normal	44	34	I
...	...	...	...	...

③基因信息表：每行一个基因，每列一个信息

g/Information	Symbol	Function
gene1	KCNA3	xxx
gene2	NCON3	Xxx
gene3	DDB1	xXx
...	...	...

• 研究目的
  大多数为找到表型背后的分子机制
• 注
  RNA测序数据与芯片测序数据可以合并分析，但不能直接合并，相当于是个分析各的，再看两个分析找到的规律是否一致

分析方法

寻找关键基因和关键样本

• 差异表达分析：哪些基因在两组样本中有明显表达差异？

  • 差异表达分析得到的表格中：
    FC(Folder change) 该基因在所检测的两组样品中表达量相差多少倍
    log2FC
    Pval(P value) 假设检验
    Padj 多重假设矫正之后的P value → 矫正之后的P value小于0.05为有显著差异
    • Questions
      ① 如何筛选差异基因，只用P value<0.05行不行？
      不行，还要FC>2 或 |log2FC|>1
      ② 该设计多少个生物学重复？
      最少3个，最好有7、8个
      ③ 是否生物学重复越多，鉴定到的差异表达基因就越多？
      是。重复越多，更多差异小的基因被识别
      ④ DESeq2 鉴定到500个差异基因，换edgeR有2000个，哪个对？
      都对，选择合适的，不同算法模式不一样，要选择适合目标测序结果的差异表达分析模型。差异表达基因少可以考虑换个模型，换个算法。
  • 差异表达分析结果可视化
    • 火山图 左上角、右上角差异越大
    • Heatmap 表达量矩阵可视化
    • Question
      ① 是否差异越大的基因越该重点关注
      否，很多是已经研究透彻的基因；可能只是结果，不是原因
      ② 差异表达基因过多或过少该如何调整？
      差异表达分析的基础是假设检验(t检验)，假设检验涉及到概率模型，有可能当前假设的概率模型并不适合当前实验结果，可以选择其他分析软件，或调整参数，更换概率模型，从而达到这种目的。

• 样本聚类分析：探索样本之间的关系，锁定关键样本，之后再做差异分析。

  • 样本间相关系数：用来描述样本表达模式的相似程度
    组间差异大，组内差异小 → 正常，反之，不正常，可能需要重做。
  • 基因间相关系数：找到与已知基因关联基因
    表达模式相似的基因
  • 相关系数：三种常用计算方法
    Pearson相关系数
    Spearman相关系数
    Kendel相关系数
    通常会关心相关系数在0.75 - 1 之间的值
  • 注：
    性别 —— Kendel相关系数
    肿瘤分期 —— Spearman相关系数

• 聚类分析和WGCNA：探索基因与表型的关系

  • 基因与表型可以做相关性分析，但是对于一个表型，不止一个基因与之相关，因此采取： 对所有基因聚类 → 用聚类后的基因簇(cluster)与表型做相关性分析
  • WGCNA分析(加权共表达分析)
    ① 模块构建(基因聚类)
    ② 性状与模块相关分析 —— 筛选出与该表型相关的gene cluster —— 对于该性状，cluster中的基因不是同等重要，用Cytoscape绘出网络图,确定在中心位置的为关键gene
    ③ 鉴定Hub基因
  • TOM矩阵(拓扑重叠矩阵)
  • 注
    大部分人该过程在PC上完成，因为很耗内存，很多都不得不滤除一些差异很小的基因

• 主成分分析(PCA)

  • 聚类分析和主成分分析都是降维分析
  • 对原来数据进行PC线性变换，通过n个PC各项加权，将m项降维至n项(n<m)
  • 要考虑的问题：
    ① 哪个PC最能体现样品的差异？
    ② 假如你关心某项功能，应该重点关注哪个PC?
    ③ 重点关注哪个PC,可以完成聚类
  • 结果图：
    hub PC：bioplot
    hub PC：表型关联
    hub genes：loadings plot

功能分析

• 富集分析：差异基因是否显著集中在某个功能分类上？
  • 功能分类：GO分类、Pathway分类
  • 富集分析结果
    GO分类ID
    Description 分类功能描述
    GeneRatio 差异基因中有多少富集在此pathway上
    BgRatio 背景，所有基因中有多少富集在此Pathway上
    Pvalue 比较以上两者，得到Pvalue
    P.adjust P值矫正
  • 最佳实践：通过ClusterProfiler软件包做
• 蛋白互作网络分析(PPI)
  • 通过已有数据库查看基因是否有关联

表达验证

• 目的：验证测序、芯片是否靠谱；测序样本生物学重复数量少，可以在表达验证掰回来，验证时多点生物学重复，增强说服力。
• 方法
  qPCR验证
  数据库检索数据验证(肿瘤数据库TCGA、正常人数据库GTEx、将两者结合在一起的数据库)
• 功能：证明相关性，但还不能证明这些基因就有这个功能

功能验证

• 实验：
  敲除、敲低
  过表达
• 人类疾病：生存分析

分子机制

TCGA等多组学关联分析

• 序列变异
• 表观遗传修饰
• 转录调控