文献学习053--[sc+st]三篇心梗文献汇总
一、梗死心脏中巨噬细胞的时空动力学和Trem2hi巨噬细胞的潜在功能
前几天Online的一篇NC，做的是心梗的单细胞+空转。
看完感觉这篇文章和同期online的做心梗单细胞+空转的这篇nature人类MI的空间多组学图谱之间的差距，得有100篇NC吧...（这篇实属单细胞套路文章）
1. Immune cell dynamics after MI
Fig 1a：对正常、心梗d1、d3、d5、d7的心脏进行了了流式分选，得到cd45+的免疫细胞，进行了单细胞测序 (每组一个样品)。
Fig 1b, c：一共得到33977个细胞，注释得到12个细胞群。
Fig 1d：细胞比例结果显示正常心脏中巨噬细胞最多，MI后1天中性粒细胞出现明显增多，随后又逐渐减少。巨噬细胞在1天时减少，随后逐渐增多。
对比下面两篇，这一篇送的时间点只有Inflammatory phase和Proliferative phase
2. Spatiotemporal profiles of immune cells after MI
Fig 2a：作者对心梗d1、d3、d5、d7的心脏进行了空间转录组测序。
Fig 2b, c：聚类得到5个cluster。梗死灶的中性粒细胞在d1时最多，随后逐渐减少，而巨噬细胞则持续增多。
3. The heterogeneity of monocytes and macrophages and their temporal dynamics after MI
这部分对单核细胞的单细胞数据进行了重新聚类，得到16个cluster，查看了一下marker基因和比例变化。
将细胞主要分为了如下几类：
steady-state macrophage (
SS-Mφ): 1, 3, 13
Ly6c2hi monocytes/Early-Mφ: 4,10,14
Transient-Mφ：7, 8, 12
Late-Mφ: 2,5
IFN-Mφ: 6, 15
proliferating macrophages: 9, 11
non-classical monocytes: 16
4. Single-cell trajectories in the infarcted heart
对所有的单核巨噬细胞做了拟时序分析，找到一些拟时相关基因。Early-Mφ 特异性基因如Ccr2, Chil3, 和 Clec4e的表达，在Ly6c2hi monocytes/Early-Mφ中上调，随后在Transient-Mφ重下调，在Late-Mφ 中处于一个较低水平。与之相反，Late-Mφ-特异性基因比如 Trem2, Rgs10 和 Fcrls，在 Ly6c2hi monocytes/Early-Mφ中下调，然后在Transient-Mφ 和 Late-Mφ 中逐渐上升。
免疫组化查看了这些基因的定位，Trem2主要在梗死灶。
5. Neutrophil and DC subpopulations
对粒细胞和DC做了亚群细分，描述了一下比例变化。（跟主线毫无关系，完全可以放在附图里）
6. The expression of Trem2 after MI
后面作者就直接关注了Trem2（是个比较火的靶点）
Trem2 is highly expressed by macrophages in the infarcted heart and sTrem2 is exclusively secreted from Trem2hi macrophages.
7. Trem2hi macrophages accumulating in injured hearts late after MI are anti-inflammatory
Trem2hi macrophages are dominant in the late phase of MI and possess anti- inflammatory characteristics.
8. Improvement of left ventricular remodeling after in vivo injection of soluble Trem2
给小鼠注射sTrem2可以改善心梗小鼠心脏功能
整个文章做的非常常规，也没有用什么有意思的分析方法。但是Trem2这个靶点还是值得关注的。
近年来，越来越多的研究表明髓系来源的细胞在各种病理学中的核心作用。其中髓系细胞触发受体2 （triggering receptor expressed on myeloid cells-2 TREM2）被认为是病理性诱导的免疫信号枢纽。TREM2是多种配体的受体，这些配体大多是组织损伤的标志。在生理状态下中，TREM2的活性仅限在特定的组织中，而在病理状态中，TREM2信号途径成为感知组织损伤并抑制损伤的免疫信号枢纽。这些发现也激发了学术界和工业界的热情，以探索调控TREM2活性的策略，并用于治疗疾病的可能性。
Cell. 2020 Jun 11;181(6):1207-1217.
二、MI的动态间质细胞反应预测不同基因背景小鼠的心脏破裂风险
这一篇是2020年发在cell reports上的文章
1. Single-Cell Analysis Defines the Interstitial Cell Landscape Post-MI
Since the epicardium, the mesothelium covering the heart, is the major source (～80%) of cardiac fibroblasts in homeostasis，作者使用了C57BL/6J Wt1Cre;RosaZsGreenf/+小鼠。这种示踪鼠的epicardial derivatives细胞(也就是心脏间质细胞)都是绿色。
作者分选了con和心梗d1, 3, 5, 7, 14, 28的小鼠心脏中活的有核细胞进行了单细胞测序。(炎症期：d1, 3；增殖期：d5, d7；成熟期：d14, d28)
一共得到了36,847细胞，注释得到16个主要的细胞群。其中ZsGreen+的细胞包括epicardium, SMC和FB I-III (5群，见E图)。
细胞比例变化结果显示心梗早期固有免疫细胞出现显著聚集，1d时中性粒细胞达到peak。单核巨噬细胞在7天达到peak。成熟期主要以成纤维和内皮为主。适应性免疫细胞和血管/壁细胞比较稳定。
Wt1在成年小鼠心脏的外膜表达，也在内脏器官的间皮中表达，可用作谱系追踪和标记Wt1表达细胞，常用于研究心脏、精子的发育及肝损伤等。
Fig 1
2. Dynamics of Stromal Populations Involved in Scar Formation
为了进一步探究stromal transition，作者将ZsGreen+的五群细胞提出来做了亚群细分，得到12群。其中3群(DC, IFN response, Epicardium)因为混杂了其他细胞，没有纳入后续分析。剩余的9群细胞，作者使用SPRING做了轨迹分析，并展示了9群的特异性通路。
⚠️成纤维亚群注释可以参考c图
epicardial-derived fibroblasts (EpiDs): Dpep1, Lpl, Hsd11b1, Cxcl14
homeostatic epicardial derived fibroblasts (HEpiDs):
progenitor-like state fibroblasts (PLSs): Cd248, Pi16, Ly6a
late-resolution (LR) fibroblasts: Adamtls2, Cilp, Col8a1, Meox1
injury response (IR) fibroblasts: Mt1-2
endocardial-derived fibroblasts (EndD): Wif1, Dkk3
Fig 2
Fig 2d中看到EndD自己出现了一个分支，作者在homeostatic ventricles中做了一下验证。结果显示marker基因DKK3在稳态下就存在于冠脉血管周和瓣膜成纤维细胞周，提示EndD从内皮转分化成成纤维的亚群是胚胎起源的，不是疾病激活的。
前面验证了EndD群，这里验证了一下injury response (IR) fibroblasts群。这群细胞高表达Mt1-2，而且分泌多种细胞因子，参与多种信号通路。随后作者使用免疫荧光验证了Mt1-2在基质细胞中的表达。
随后，作者探究了Myofb, MFCs 和 LR在MI后的心室重塑中的作用。
Figure 2D中的结果显示 EpiD ZsGreen+ 细胞和 Myofb 细胞存在一个线性分化关系。有3群Myofb被鉴定出来，包括主要存在于d3-d7的Myofb (Acta2, Cthrc1), ProlifMyofb (Acta2, Cthrc1, cell-cycle genes)和一群最近鉴定出来的主要存在于d14-d28成熟scar中的 matrifibrocytes。
Compared to Myofb, MFCs had reduced expression of genes associated with contractility (Acta2, Tagln, Tpm2, and Myl9) or ECM components (Timp1, Tnc, Cthrc1, and Col1a1), but expressed Comp and Angptl7 and Fbln1 and Cilp, supporting the transition to a less contractile, less secretory cell type producing components of a more stable, chondrogenic-like ECM.
为了可视化这些细胞间的关系，作者使用ACTA2和CTHRC1作为 Myofb的markers，使用SFRP2和CLU作为 MFC的markers，进行了免疫荧光染色。Myofb主要在5-7天比较多，MFC则主要在d14-d28比较多。qPCR也验证了上面的结果。
3. Genetically Determined Factors Confer Resilience to Cardiac Rupture
不同品系的小鼠在相同处理下心脏的反应性不同。作者探究了9种对MI具有不同反应性的小鼠C57BL/6J or B6J (control), 129S1/SvlmJ or 129 (prone to hypertension), DBA/2J (prone to calcification), NOD/ShiLtJ (prone to type 1 diabetes), NZO/HlLtJ (obese), A/J (prone to muscular dystrophy), and three wild-derived strains (CAST/EiJ, WSB/EiJ, and PWK/PhJ)对MI的反应性。其中129的rupture率(59%)最高，B6J小鼠只有(13%)。
为了探究rupture的机制，作者取了MI d3 (pre-rupture)的B6J和129小鼠的心脏间质细胞，进行了单细胞测序。两组间的细胞比例显示Post-MI 129 心脏的 Myofb, ProlifMyofb 和 IR fibroblasts 比 B6J 要多。
和c57相比，d3的129 MI小鼠间质细胞出现了3922个差异表达基因，a图展示了差异分析富集到的通路。b-d图展示了血管生成反应、ECM沉积、急性期反应和凝血三条通路中的关键基因的表达。这些基因在129 MI小鼠间质细胞显著升高。
In summary, the increased susceptibility of 129 hearts to rupture is associated with persistent coagulation and impaired fibrinolysis that increases instability in the injury site, which is also supported by the higher responsiveness to angiotensin.
三、单细胞测序揭示心梗后内皮细胞可塑性和瞬时间质活化
这一篇是21年的一篇NC，对心梗不同点的小鼠心脏的非心肌(包括内皮和成纤维)进行了单细胞测序，主要关注了内皮细胞。
1. Kinetics of EC inflammation, survival, and proliferation.
作者对con和MI后d1, 3, 5, 7, 14和28的小鼠非心肌细胞进行了单细胞测序。（和上面那篇的分组一模一样哦），得到19群细胞 (4群内皮，5群单核巨噬，1群T，1群B，6群成纤维)。在MI 1w内，内皮和间质细胞比例下降，免疫细胞增多。随后作者对不同时间点的EC做了通路富集，发现早期缺氧通路活化，相关基因Hif1a, Ldha以及炎症因子Il1b, Il6 和 Tnf在早期出现上调。而在d1-d7，内皮间质转化通路被富集到。细胞周期分析也显示d3时候分裂期细胞增加，分裂期相关基因表达也增加。
2. ECs acquire a transient state of mesenchymal transition after MI.
随后对EC细胞做了拟时序分析，得到5个state。
可以看到MI后d1和control相比，state 2出现了明显增加。这一群的特异性基因和通路富集提示它与中性粒细胞脱颗粒和炎症反应有关。在MI后1-7天的时间里，state 4出现明显增加，随后又下降。这一群细胞主要富集到extracellular matrix，脂肪酸摄取信号通路则出现下调。state 4的特异性基因包括间质基因，细胞周期基因和增殖基因如Col3a1, Fn1, Serpine1。
state 4的间质转化相关基因在早期出现上调(d)，分选了con和AMI d3的cdh5细胞进行bulk RNA测序也得到了一致的结论(e)。
当对所有的EC(clusters 6, 7, 17, and 18)进行分析的时候也发现了存在EC基因表达下降和间质基因表达上升(f, g)。
This suggests that EC acquire a transient mesenchymal activation (EndMA) state in the first week after MI.
随后作者对EC进行了亚群细分，得到了间质内皮(4-6)和幼稚内皮。间质内皮和幼稚内皮都出现了早期MI后内皮基因表达的丢失 (c) 和间质基因表达的上升 (d) 。间质内皮细胞在d1-d7比例上升，state 4的细胞也主要是间质内皮细胞。
随后作者通过免疫荧光检测了心脏梗死后D3的内皮间质基因表达，发现表达增加。
isolectin B4染色评估新生血管情况
MI不同时间点心脏，示踪鼠(内皮绿色)和间质marker Pdgfra共染，也提示早期间质内皮的增加。
为了证实间质细胞可以revert to 内皮细胞表型，作者使用了Col1a2-CreERT2;mT/mG 鼠进行了collagen-tracing 研究 。小鼠在诱导MI后d3, 4, 5, 6,7 给了tamoxifen，28天的时候送了单细胞测序。结果显示EC中存在GFP+细胞。提示Col1a2 traced cells can become transcriptionally similar to endothelial cells between day 7 and day 28 after infarction. 荧光结果也提示GFP阳性细胞和内皮marker Isolectin B4存在共表达。
3. Characterization of EndMA cells.
为了进一步理解EndMA的特性，作者将表达间质marker的EndMA+和不表达间质marker的EndMA-细胞做了差异分析和功能富集。结果显示EndMA细胞高表达间质和细胞外基质基因。上调的通路包括extracellular matrix organization, Pdgf binding, collagen synthesis, and organization等。
此外两组细胞间还出现了明显的代谢差异。EndMA细胞高表达糖酵解相关基因，EndMA-细胞则高表达三羧酸循环和脂肪酸代谢相关基因。
对不同时间点的内皮进行分析也提示MI后d1的内皮细胞出现明显糖酵解基因的高表达，d3则转化为三羧酸循环相关基因，documented an adaptation of EC metabolism during the time frame in which mesenchymal activation occurs.
4. Cdh5-lineage tracing confirms the transient nature of EndMA after MI
前面的数据表明，MI 在与 EndMA 相关的内皮细胞中诱导了短暂的代谢和表型转换。 然而，在没有谱系示踪的情况下，我们可能错过了完全转变为间充质表型并失去 EC 标记基因表达的 EC。 为了表征 EC 的长期命运，作者使用了endothelial fate-mapped mT/mG reporter mice (Cdh5- CreERT2;mT/mG)，并对不同MI时间点的小鼠心脏非心肌进行了单细胞测序，结果显示他莫昔芬注射导致预期的 GFP 在内皮细胞中的诱导(a-c)。
为了探究EndMA的动力学，作者评估了不同时间点间质marker在GFP+细胞中的表达。和预期的一致，GFP+Cdh5+的内皮细胞在d3, d7的时候，间质marker Col1a1, Col3a1和Serpine1表达出现明显增加。但是有趣的是，在晚期d14, d28并没有观测到明显的完全转化的(不表达内皮marker的) mesenchymal GFP+ 细胞的增加 (d)。
作者对GFP+细胞的重新聚类鉴定出了一群EndMA (cluster 6)，这群细胞高表达胶原但是低表达内皮marker。这群细胞也是在d7比例更高，consistent with a transient mesenchymal transition of ECs after MI。
5. Mesenchymal transition is reversible in vitro.
前面的研究结果提示心梗后，内皮细胞 transiently 获得 reversible partial mesenchymal state。所以作者在体外验证了这个结论。
作者在体外将EC和TGF-β2共孵育了3天，然后撤回刺激。3天的TGF-β2孵育诱导EC表达了间质marker calponin (CNN1) 和 SM22 (TAGLN)，孵育3天后撤销TGF-β2的内皮在d7时的间质marker表达恢复到正常水平，而在1-7d持续孵育TGF-β2的内皮则在d7时间质marker的表达进一步升高。（使用TGF-β1, IL-1β和L-NAME的组合来诱导内皮间质转化也得到了一致的效应）
为了探究TGF-β2的干预是否引起了true fate change，作者分析了间质基因的DNA甲基化情况。结果并没有观察到间质基因COL4A1, TAGLN和CNN1在给予TGF-β2干预和撤退后出现了DNA甲基化，However, we observed a reversible demethylation of regulatory regions upon TGF-à2 stimulation (Supplementary Fig. 17d)。
These observations confirm that mesenchymal gene expression induced by several different protocols is reversible and is associated with changes in DNA methylation of regulatory regions.
