Q＆A | 单细胞测序常见问题＆解析，助您拨开迷雾！
高通量单细胞测序是近年来生物学领域最热的技术之一，凭借其极高的分辨率能够精准的剖析样本细胞组成信息，结合高通量测序方式，进而大规模的揭示细胞间的异质性。接下来我们整理了一些用户经常遇到的问题，分享给大家，希望可以为您答疑解惑。
Q1: 单细胞样本取样后不好保存怎么办？
如果想要是短期保存，可以在取样后进行清洗，添加适量的组织保存液，于4℃保存48h-72h。如果是长期保存，又想做单细胞测序，可在获取样本后，进行清洗剪碎，使用我们的组织冻存液进行梯度冻存，于-80℃长期保存，而且组织复苏后，对细胞活率等影响也不大。如果取样后对组织进行液氮冷冻，保存在-80℃，这种情况就建议提核了。
Q2: 单细胞免疫组库测序和单细胞转录组测序可以同时做么？送样量会增加么？
这个是可以同时做的，在实验油包水反转成cDNA后，对cDNA进行扩增，这部分CDNA一部分可用于构建单细胞文库，一部分可用于构建免疫组库文库。所以送样量不会增加，和单细胞转录组的送样要求相同。
Q3: 我的样本不同时间获得，会有批次效应么？
像单细胞测序，一个芯片同时只能测8个样或16个样，样品多的情况下，都会有批次效应，而且样本处理时间、处理人员等也有可能导致批次批次效应，但我们在后续分析时，会通过生信手段去除批次效应。
Q4: 3‘ 转录组和5‘ 转录组有什么区别？
10x单细胞转录组建库有5‘端和3’端建库两种方式。在3’端的建库中，Gel
beads的末端序列是poly（dT），用于和转录组3’端的polyA结构互补配对。而在5’端的建库中，Gel
beads的末端序列是TSO序列，其末端有polyG的结构。转录本会在酶的作用下在其5‘端加上polyC的结构，由此完成配对。
VDJ建库的捕获固定采用5’端捕获方法，目的是为了在保证序列长度较短的情况之下富集到位于5’端的多变VDJ区域，而不是位于3’端的较为保守的C区域，这段区域通常不是重点的研究方向。
Q5: 哪些组织建议做单细胞核测序？
像含有心肌细胞、脂肪细胞，神经细胞的组织，由于细胞比较大，更建议提核。不过脑组织也有做单细胞悬液的，关键看您是更关注神经元，还是更关注其他细胞，如果做提核的话，神经元细胞比例会接近真实水平，如果做单细胞悬液，由于酶刺激或过筛等操作，会导致神经元细胞相对少一些。
Q6: 都是单细胞测序，10X单细胞测序和smart-seq有什么区别？
smart-seq是一个细胞建一个文库，因此价格是按照细胞数目进行计算的，这决定了当细胞通量达到较大数值时，项目预算会非常巨大。10X是一个样本一个文库，单个样本的细胞数目是几千到一万，因此价格核算到细胞水平，每个细胞的价格在几元。因此10X单细胞测序更有利于高通量的单细胞转录组研究。Smart-seq是一个全长转录组的测序，10X单细胞只针对3’端或5’端的150bp的测序，因此，如果想要关注全转录本的序列，smart-seq是更好的选择。
Q7: 在制备细胞悬液时候，活率低，结团率高，是否可以继续实验？
一般来说，单细胞悬液质检要求：细胞活率＞80%, 细胞结团率＜10% ,活细胞浓度范围: 400 ~ 1000 cells/μl,有核率＞70%。但也应根据具体实验材料而定，细胞活率70%也有成功案例，结团率30%也有成功案例。
Q8: 在样本质检合格的情况下，一般情况下细胞数在预期细胞数的0.5-2倍之间，细胞数与预期相差较大的原因有哪些？
1. 样本质量与特点：如样本活性/有核率/是否含中性粒/是否含色素等；
2. 细胞计数的准确性：现有技术以对通透性的检测的结果代替细胞活性，这个方法并不完全准确，有时候会测到的活性很好，实际上没那么好的情况；
3. 操作的准确性；
4.10X油包水过程的情况：油包水过程本身没法指控，大体上是稳定的，但有一些时候会不正常，极端的时候就是油包水基本没生成，这个可被肉眼观察发现，但界于中间的一些状态无法肉眼判断，比如油包水实际效率下降了，但仍然生成了乳浊状态，这个也有可能是细胞数偏差的一个原因；
5. 与单细胞识别的算法有关，算法是依据标准样本做的模型，对于质量低的样本有时可能会造成细胞数偏差增大。
Q9: Fraction Reads in Cell出现报警是什么原因？（低于70%)
1.环境中RNA含量较高，这种环境RNA来自样本中裂解/死亡的细胞。可能是样本状态不佳导致。
2.RNA含量变化可能比预期的要高，也就是RNA含量低的细胞更多，但是Cell Ranger将barcode划分成细胞或者是背景的时候，是根据转录本的情况进行划分，所以有的细胞因为RNA含量低而被当成了背景。
3.存在非特异性扩增，出现了非特异性片段较多，导致背景中reads较多。
但无论是哪种情况，都不影响我们后续的使用 ，因为我们后续分析都是有效的reads。
王贝 | 文案
