单细胞核转录组测序
单细胞核转录组测序（Single Nuclei RNA Sequencing，snRNA-seq）：通过提取样本单细胞核，然后分离、标记细胞核，在单细胞水平研究核基因表达检测的技术。为脑组织、心脏、肾脏等复杂组织或一些珍稀冻存样品提供了单细胞水平研究应用平台，可挖掘更多潜在的致病细胞类型，更易于探讨肿瘤细胞异质性和致病机理。
单细胞核测序（snRNA-seq）的优点
- 细胞核的获得比细胞悬液的获得简单
单细胞悬液制备过程往往是造成实验可变性的主要因素。如何获得足质足量的单细胞悬液？这是实验面临的第一个难题，特别是那些稀有细胞或难以解离的细胞；细胞核膜相比细胞膜更为坚固，因此，冻存组织细胞膜破裂后细胞核则能够保持完整，由于仅涉及机械破碎和简单的纯化，snRNA-seq操作步骤相对简化，便于开展实验，其稳定性相比scRNA-seq大大提高。
- 适用的样本类型扩大
单细胞核测序snRNA-seq由于是抽提细胞核进行测序，所以可以应用于冻存的样本，极大的利用了那些生理病理数据清晰的冻存样本；对于那些新鲜样本解离成功率低的样本；或者是样本的收集难度大，收集周期长，比如一个样本不同阶段的评估，或者根据治疗结果决定前端样本是否入组等情况；亦或是细胞体积大，形状不规则的样本都可以用snRNA-seq来解决。
- 降低人为引入的转录偏差
因为组织可以直接从冻存状态开始抽核，此状态下细胞转录活动已经被抑制并固定，因此不会再发生转录状态改变，结果真实性提高。
- 能够鉴定到的细胞类型更为全面和完整
直接对细胞进行机械法或者化学法破碎，不会引入解离偏好性，理论上来讲所有细胞类型都能得到回收，能够获得更加完整和全面的细胞图谱。
单细胞核测序（snRNA-seq）的缺点
- snRNA-seq会有检测到的基因偏少的风险
虽然有一些比较单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞核（snRNA-seq）测序的研究表明，转录本在整个细胞和细胞核中的表达程度相当；理论上来讲，缺失了细胞质中的RNA分子，snRNA-seq在鉴定细胞转录状态中可能不如scRNA-seq，同时由于细胞核中带有polyA尾的成熟mRNA比例更低，因此对于某些样本而言，采用snRNA-seq每个细胞核中检测到的基因可能会有偏少的风险，不利于细胞亚型的鉴定。
- snRNA-seq对免疫细胞类型的获得不友好
虽然snRNA-seq能够获得更加全面完整的细胞类型，但是对于某些细胞类型的获得比例不如scRNA-seq，主要表现为免疫细胞。
Slyper, M., Porter, C.B.M., Ashenberg, O. et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med 26, 792–802 (2020). https://doi.org/10.1038/s41591-020-0844-1
以上这篇文章对8个肿瘤类型，同时进行scRNA-seq和snRNA-seq，结果发现：scRNA-seq数据中神经嵴、神经内分泌细胞大幅度减少、实质细胞大幅度减少；snRNA-seq数据中T细胞大幅度减少、B细胞和NK细胞消失、内皮细胞、上皮细胞增加。
https://zhuanlan.zhihu.com/p/394585391
单细胞核核转录组的基因组比对
这里主要讲一下核mRNA和细胞mRNA的区别：在细胞和里面主要有大量的pre-mRNA，这部分有内含子信息。一般的数据经验是PBMC内含子比对上的约为20%，核转录组45%。
要理解这个过程，需要了解意向mRNA的形成和核运输的基本机制。同时要知道被我们捕获的PolyA是什么时候加到3‘端的。这里推荐阅读《基因X》。
化学生物学
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然后我们看看文章里面是如何做的：
- 更改GTF。把注释部分的内含子改为对应的转录本
- 在比对时候，比对到内含子上。
考虑到核mRNA的差异，在下游分析的时候还是有一些需要注意的地方的。
Habib, N., Avraham-Davidi, I., Basu, A. et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nat Methods 14, 955–958 (2017). https://doi.org/10.1038/nmeth.4407
虽然单细胞核的平均表达谱与单个细胞的平均表达谱高度相关(Pearson r=0.87)，但在细胞核(如lncRNAs Malat1和Meg3)或细胞(线粒体基因Mt-nd1、Mt-nd2、Mt-nd4、Mt-nd4)中表达显著较高的基因(如lncRNAs Malat1和Meg3)或细胞(线粒体基因Mt-nd1、Mt-nd2、Mt-nd4、Mt-cytb)与已知的核与非核的明显富集相一致。
单细胞核测序能不能测到 线粒体基因？ 让我们看一个实例：
Al-Dalahmah, O., Sosunov, A.A., Shaik, A. et al. Single-nucleus RNA-seq identifies Huntington disease astrocyte states. acta neuropathol commun 8, 19 (2020). https://doi.org/10.1186/s40478-020-0880-6
Nuclei with percent exonic reads from all reads in the range of 25–75% were included. Nuclei with percent mitochondrial reads aligning to mitochondria genes of more than 14% were excluded. Genes were filtered by keeping features with > 10 counts per row in at least in 31 cells.
