实用干货|单细胞测序之细胞悬浮液制备知多少

单细胞测序技术可在单个细胞层面进行高分辨率的分析，从而揭示单个细胞的状态和功能，避免了传统基因组技术平均信号所产生的结果误差。近年来，单细胞测序技术迅猛发展，在肿瘤、发育、免疫学、神经科学、干细胞分化、大规模细胞图谱构建等研究领域得到广泛应用，在单细胞实验中，能否获得高质量的单细胞悬液是成功关键，而复杂多样的组织类型给该悬液制备工作带来了极大的挑战。今天小编带大家全面的介绍如何从组织样本中获得高质量的单细胞悬液。

01单细胞组织消化难点

人体由有机质和无机质构成细胞，由细胞与细胞间质组成组织，由组织构成器官，功能相似的器官组成系统，由八大系统组成一个人体，其中，人体四大组织分别是：上皮组织、结缔组织、肌组织、神经组织。

人体四大组织

上皮组织由密集排列的上皮细胞，和极少量细胞间质构成的动物的基本组织。依功能和结构的特点，可将上皮组织分为被覆上皮、腺上皮、感觉上皮等三类。神经组织由神经元和神经胶质细胞构成，具有高度的感应性和传导性。神经元由细胞体、树突和轴突构成。肌肉组织，由肌细胞构成。肌组织按形态和功能可分为骨骼肌、平滑肌和心肌三类。结缔组织由细胞、细胞间质和纤维构成。结缔组织主要包括：疏松结缔组织、致密结缔组织，脂肪组织、软骨、骨、血液和淋巴等等。因此，不同类型组织有着不同的细胞组成，也具有不同细胞排列方式，这导致在进行组织消化时，需要摸索不同的实验条件，如酶的类型、酶解时间、酶浓度、机械损伤、离心条件、环境温度、缓冲液等均可能影响细胞活性，其难度可想而知。

组织的分类

02单细胞组织消化目标

为保证后续单细胞实验的顺利进行，需要对细胞悬液进行严格质控。为保证单细胞样品活性，建议用新鲜组织制备单细胞悬液，如果取样后无法立即进行试验，可将组织保存在组织保存液中（MACS Tissue Storage Solution），4℃保存，48小时内进行消化。

质控参数：

细胞活率＞90%；

细胞结团率＜5%；

活细胞浓度范围: 300-600 cells/μl

细胞直径范围: 5-50μm；

有核率＞70%。

荧光 明场 细胞直径分布

03单细胞组织消化过程

解离前将组织尽量切碎，以增加酶与组织的接触面积，切碎组织时可以加少量含10% FBS的细胞培养基，避免组织细胞脱水。酶消化法是利用酶将细胞间质（间质纤维、间质蛋白等）去除，使细胞脱落分散。由于不同组织的细胞间质不一样，因此需要选择特定的酶和特定的消化时间。常用的消化酶有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胶原酶、中性蛋白酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶等。

单细胞组织消化过程

04单细胞组织消化注意事项

得到细胞悬液后，需要按上文的质控标准对细胞活率、结团率、浓度、直径分布等参数进行质检，如果这些参数不能达到预期，则需要根据具体情况对悬液质量进行优化。

1） 去除死细胞：如果细胞活性较低，需要通过去死细胞实验来提升活性，通常，细胞活性在60%-75%区间时去死细胞提高活性的效果较好。

2） 红细胞裂解：如果直径6-8μm的细胞占比较高，且有核率偏低，这表明红细胞含量可能较多，需要进行红细胞裂解，如果红细胞裂解依然不干净，不建议增大裂解体系，建议适当延长裂红时间，或适当增加裂红次数。

3） 降低结团率：导致结团率高的原因主要有组织没消化完全或细胞释放的DNA导致细胞黏连，因此需要针对不同情况，采取调整消化条件、DNA酶处理、轻微吹打细胞团等措施进行优化。