生信小白组装学习系列：初识Canu与其组装实战训练(3)

随着技术的进步，还有各种流程工具的推出，三代测序PacBio和Nanopore在测序，还有基因组研究中越来越扮演着角色。掌握一些三代技术组装的知识，是未来作为生信工作者必不可少的技能。这次推文会给大家带来很多人都很熟悉的一款工具Canu，这里会简单探讨一下其使用的方法，给还没有接触过该工具的小伙伴，带来一些基础的认知。

Canu的介绍

简介
Canu是专门设计给组装PacBio或Oxford Nanopore长序列的一款工具。输入的序列可以是FASTA或FASTQ格式，未压缩或使用gzip（.gz），bzip2（.bz2）或xz（.xz）压缩的格式。但注意，Canu暂时并不支持zip文件（.zip）。

特点
Canu支持断点运行，允许从系统中断或其他它常终止中断点运行。每次重新启动Canu时，它都会检查程序集目录中的文件，以决定下一步该做什么。例如，如果除了两个组装任务之外的所有任务都已完成，那么当其重新启动之后，Canu仅会进行运行所缺失的两个任务。为获得最佳结果，请勿在重新启动，中途时候更改Canu的参数。Canu具有智能的检测功能。Canu能根据当前服务器所有可用的资源，自动检测计算资源并扩展调整自身参数的配置。当然你也可手动去调整，可以使用参数maxMemory和maxThreads明确限制内存和处理器的数目。

对数据的要求

对于真核基因组，理论上超过20倍的数据覆盖率，足以胜过当前的混合组装的方法。但Canu建议是，最小的数据深度范围为30倍至60倍。因为更深的覆盖度，将让Canu使用更长的读取进行装配，这将导致更好的组装结果。

运行流程

Canu分三个阶段进行组装运作：

• 修正 (Corret)
• 修剪 (Trim)
• 组装 (Assemble)

x修正阶段将会提高reads中碱基的准确性。修剪阶段将reads修剪到，看起来像高质量序列，并删除可疑的区域，例如剩余的SMRTbell的adpaters。组装阶段将reads排序为contigs，生成对应的共有序列(consensus suquences) 并创建可能的共有序列互相相连的路径。

Canu的安装

目前Canu的最新版本是1.8，大家可以直接到官网下载其安装包，然后解压编译：

gunzip -dc canu-v1.8.tar.gz | tar -xf -
cd canu-1.8/src
make -j 8
cd ..

又或者使用已经编译好的版本(最推荐)：

wget https://github.com/marbl/canu/releases/download/v1.8/canu-1.8.Linux-amd64.tar.xz

tar -xJf canu-1.8.*.tar.xz

又或者使用conda进行下载安装：

conda install canu

基本运行参数

usage:   canu [-version] [-citation] \
              [-correct | -trim | -assemble | -trim-assemble] \
              [-s <assembly-specifications-file>] \
               -p <assembly-prefix> \
               -d <assembly-directory> \
               genomeSize=<number>[g|m|k] \
              [other-options] \
              [-pacbio-raw |
               -pacbio-corrected |
               -nanopore-raw |
               -nanopore-corrected] file1 file2 ...

实战分析

这里使用一组细菌的数据来练练，并且熟悉使用Canu组装的整个流程。首先简单介绍一下我们使用到的数据。我们即将组装的细菌叫苏云金芽孢杆菌菌株，其strain是HS18-1，该细菌对双翅目的害虫具有一定的杀虫活性。该原始数据大小为1.5Gb，组装出来的基因大小为6.4Mb。

数据和运行

该数据存储于ENA中，然后这里我们只选取pacbio的数据进行下载：

wget ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR209/006/SRR2093876/SRR2093876_subreads.fastq.gz

然后就可以直接使用canu开始运行了：

canu -p Bt2 -d Bt2_assembly genomeSize=6.2m  -pacbio-raw SRR2093876_subreads.fastq.gz

这个组装大概需要1个多小时去完成，生成的组装文件在Bt2_assembly/Bt2.contigs.fasta，另外其他可能有用的文件Bt2.unassembled.fasta （没有被组装好的reads），Bt2.report This file （包含了每一步的运行信息）。

如果你想知道canu究竟执行了什么脚本，我们可以到canu-scripts目录去查看其运行的脚本：

ls Bt2_assembly/canu-scripts/

###屏幕显示
canu.01.out  canu.02.out  canu.03.out  canu.04.out  canu.05.out  canu.06.out  canu.07.out  canu.08.out  canu.09.out  canu.10.out  canu.11.out  canu.12.out
canu.01.sh   canu.02.sh   canu.03.sh   canu.04.sh   canu.05.sh   canu.06.sh   canu.07.sh   canu.08.sh   canu.09.sh   canu.10.sh   canu.11.sh   canu.12.sh

Canu的最基本最基本的介绍到这里就结束了，看起来还是蛮简单易懂的，入门的目的算是达成了，但是呢，这离真正掌握熟悉整个三代组装，还是有一段距离的（因为组装植物，动物等等的难度可是比细菌高很多，然后这里还没有设计太多polish的内容）。这里就先挖下一个坑，忙完这一段后日后还是要抽时间好好再实战学习三代组装的流程，毕竟未来是三代测序的时代呀。

如果你觉得你离组装还太遥远，不要紧，下期会给大家带来如何评估组装好的基因组质量的推文，会更加实用简单易懂，最后给大家附上Canu其他一些使用教程：

1. Canu官方最完整的使用教程：https://canu.readthedocs.io/en/latest/tutorial.html
2. Canu使用遇到的常见问题（你遇到的问题百分之九十会出现在这里）：
   https://canu.readthedocs.io/en/latest/faq.html