2020-10-01--cancer cell

A High-Resolution Map of Human Enhancer RNA Loci Characterizes Super-#enhancer Activities in Cancer

一、结果

1、核心观点：eRNA位置的高分辨率图谱表明增强子在癌症中显著活化

亮点：

①超级增强子包含离散的eRNA基因loci，其特征是具有尖锐的eRNA峰
②这种eRNA基因座的表达受动态、定位良好的核小体调控
③eRNA信号对基因表达以外的定量序列具有解释力
④超增强子的活性在癌症中受到不同机制的失调

二、摘要

eRNA活性可以从eRNA信号值判断，信号值测定需要知道eRNA具体的染色体位置。作者整合了大队列的RNA测序数据来定义super-enhancer区域，super-enhancer包括许多游离的eRNA loci，特征为尖锐的eRNA表达峰。这些 eRNA loci 受保守的，定位良好的核小体调控，并且在癌症中常常失调。

三、介绍

①H3K4me1和H3K27ac的染色质修饰是增强子鉴定的有效标记；
‘‘stretch-enhancer’’ and ‘‘su-per-enhancer’’ 指代eRNA显著活化的大的基因区域，chip-seq显示通常超过10Kb，常用eRNA标记来表示，如H3K27ac，它们往往受到许多转录因子（TF）的调控；
②增强子在激活时，打开局部染色质并暴露DNA基序以吸引TF，从而进一步招募RNA聚合酶（通常为RNA Pol II）产生增强子RNA（ERNA）
③FANTOM项目--CAGE-defined enhancers--鉴定了约65000个位点；然而应用到TCGA上确只鉴定出15000个，限制了eRNA的应用，同时CAGE-seq不能很容易地应用于大量的肿瘤样本，如TCGA；
④为了更全面的注释eRNA，作者注意到了super-enhancer，相比于传统的eNRA。super-enhancer覆盖了调控信号最为丰富的370 Mb DNA序列；super-enhancer显示出更强的RNA poll II结合信号，在没有基于CAGE-seq注释的情况下也能被 TCGA mRNA seqdata检测到；super-enhancer常＞10Kb，而经典的enhancer常为200bp；因此super-enhancer的转录噪声混淆了真正的增强子激活信号；最后这些super-enhancer区域已使用一致的H3K27ac芯片序列图谱在多种组织和细胞类型标记出来。
⑤我们假设，通过结合许多个体的RNA-seq数据，可以解析超级基因组中精确的eRNA位点样本。这个这是因为eRNA阅读与真正的增强子活性相关，反复累积，而背景转录噪声往往随机发生。

四、结果

1、频繁的eRNA表达峰在super-enhancer中

①我们首先关注了核心super-enhancer，5MB，＞20（86）个组织或细胞中被一致的鉴定出来
②为了验证RNA Pol Ⅱ结合活性，我们检测了它们的eRNAs与H3K27ac的结合（140个cell line），＞80%正相关
③按每个癌症种类，整合RNA-seq数据，并于29种核小体图谱数据相结合，使用GTEx RNA-seq数据验证模式和FANTOM-CAGE-seq增强子数据推断 （鉴定eRNA loci）的基本原理
④我们鉴定出了＞300000个eRNA位点的精细图谱，建立了一个泛癌eRNA图谱；
⑤通过一个肿瘤对免疫治疗反应的案例研究，我们证明了这种图谱在解释复杂的基因型-表型关系中用于eRNA分析的能力
⑥我们使用32种癌症类型的整合RNA序列数据集计算了5 Mb核心超级增强子集中所有串联10 bp DNA窗口的eRNA表达水平，我们注意到在超级增强子bodie上有高度反复出现的尖锐eRNA表达峰。如670bp区域所示，这是近一半（组织/细胞类型（）中最一致确定的超级增强区域之一，也是癌症类型中表达最多的区域之一；
⑦eRNA表达峰的高度具有一致性，导致32中癌症可以据此划分为四个聚类，见图B。
⑧为了系统地鉴定这种eRNA峰，我们搜索了1531个核心超增强子在所有可能的200bp窗口中的局部最大表达水平，并且鉴定了至少在三个癌症中重复的29828个eRNA表达峰，发现绝大多数eRNA峰的长度只有100 bp，然后很快下降到基线水平

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⑨此外，我们在这些峰的主体或边界上未检测到splicing motifs的富集，这与在内含子-外显子连接上观察到的强信号相反。我们在两条链的eRNA峰的任何一个边界上都观察到一个强信号tandemTF结合motif（图3D）；支持它们是由转录起始而非RNA剪接引起。

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⑩这些结果表明，在超级增强子中存在生物学意义上的有意义的eRNA位点，它们产生了离散的、反复出现的、短的eRNA，RNA-seq很容易检测到

2、eRNA的表达受位置良好的核小体调控

①我们观察到的eRNA峰短至100 bp，这一长度接近于由典型核小体（染色质组织单位）占据的147 bp DNA单位。由于核小体动力学是TF与DNA基序结合的一个关键特征，我们推测超级增强子中的eRNA峰是由核小体水平上染色质组织的变化形成的，这与TF结合激活的超级增强子有关。
②激活后，核小体被分解，使motifs可用于TF识别，然后启动转录并产生观察到的eRNA。激活后，从TFs释放的癌基因序列很快就会被核小体重新要求保护。这些核小体的“状态开关”很可能释放出一单位147bp的DNA，从而解释了eRNA峰的短（100bp）和尖的形状（提问：RNA测序会检测到DNA吗？）
③我们研究的超级增强子是组织特异性的，因此，在大多数受检组织中，核小体应该占据eRNA位点，因此在检测组织中核小体结合信号时可以检测到位置良好的核小体。
④当super-enhancer被激活时，占据eRNA位点的核小体必须被TF替代，然而TF需要与侵入的核小体竞争结合位点，核小体的周期受多种因素调控，如消化时间、复制阶段、盐浓度等；由于核小体变化周期短暂，这种核小体信号难以被检测。
⑤为了验证这一假设，我们收集了MNase-seq（消化时间）数据，发现核小体占有率在各个组织细胞中是类似的，说明在宏观进化中，这种核小体占有率是保守的
⑥核小体的占有率可以用MNase-seq信号来表示。

3、超级增强子的eRNA基因座的全局识别

①两个关键信息：一个超级增强子包含许多短于100bp的eRNA；这些eRNA位点往往与定位良好的核小体重叠
②鉴定了140bp窗口内的最大的eRNA RPKM，鉴定了超过400万的eRNA峰，然后计算了每个位置的核小体信号（NMase-seq），用PCA算法分析具有最大MNase seq信号的位置与本地最大eRNA RPKMs的位置之间的距离，；PC1有效地反映了侧翼140bp区域的平均MNase-seq信号强度；PC2和PC3代表了核小体位于eRNA表达峰附近的阶段；PC2和PC3将这400万个eRNA分为三类；PC2代表核小体在峰值位置上游或下游的相对占有率（图5B和5C），而阴性PC3则表明核小体占有率和表达信号之间的同步性（图5C），负PC3是一个良好的指标表明eRNA的表达峰与核小体占有率（mean mapped reads）重合在了一起；相比之下，PC1强调的是核小体定位的重要性。

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③PC3与该区域确定为super-enhancer的数量成一个 负相关

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④基于eRNA基因座的排列分析，建立了两个识别eRNA的标准：1）与位置良好的核小体一致（PC3<0）和；2）具有尖锐的eRNA表达峰（相对峰高>0.05）；通过这两个标准，识别了30万个eRNA loci，每个TCGA癌症识别到了50000-120000个eRNA loci。说明eRNA具有组织特异性。在超级增强子区域中识别到了更多的这样的位点，与super-enhancer RNA pol II芯片信号一致。
⑤例如22号染色体上，在基因组相邻区域，eRNA loci密集区域，eRNA共表达和异质性（不共表达）广泛存在
⑥我们通过以下几方面来验证eRNA loci 的准确性

1）分析了eRNA loci 的平均CAGE-seq signal，Cage-seq在Watson或Crick链的eRNA位点上游60 bp处检测到增强子转录起始信号的尖峰
2）在15 paired-end MNase-seq samples中，超过60%的eRNA位点被定位良好的核小体占据（≥5个样本）

4、eRNA的表达为临床表型提供了额外的定量能力

①首先，根据最近一项基于CAGE的研究，与mRNAs（<5%）相比，eRNAs（>30%）具有更高的细胞类型特异性。肿瘤常含有不同的细胞组织类型，因此本研究中检验到的eRNA峰，主要局限于少数癌症类型。
②eRNA水平可能保留更多的细胞类型特异性信号。因此，对于由一种或几种特定细胞类型决定的复杂性状，如免疫治疗反应和内分泌抵抗，差异表达的eRNA信号可以在数量上合理地表达差异表达的mRNAs。
③如在28个对抗-PD1免疫疗法有差异反应的黑色素瘤肿瘤中，这种反应需要T细胞、肿瘤细胞和微环境中的其他细胞阵列之间的相互作用，我们发现20000个编码基因中没有一个显示出显著的差异表达，但是我们发现了164个有差异的eRNA，他们全部都被活化，虽然分布在不同基因位置，我们通过eQTLs鉴定了他们的36个目标gene，通过gsea分析，富集到了不竭性CD8+T细胞基因虾条和过度表达的扩张性CD8+T细胞。表明这些eRNA对于CD8+细胞十分重要。为了进一步验证，我们研究了这164个eRNA与其它免疫细胞相关的基因集之间的相关性，同时这些GSEA基因集与患者预后相关

5、eRNA loci 失调，在癌症中表现出临床相关

①肿瘤相对于正常组织，super-enhancer显著激活
②eRNA位点的很大一部分受焦点拷贝数扩增的驱动因素影响，比受驱动因素缺失影响的可能性高4倍（图7B），这与蛋白编码基因结果相反。合并多种癌症复杂病例时，该种模式也成立。

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③我们发现4000erna基因座至少包含一个TCGA项目中使用的人类甲基化450k阵列的CpG甲基化探针，在这些探针中，1187个（>30%）CpG二核苷酸在DNA甲基化水平上显示出显著变化（图7E；>20%绝对变化；FDR<0.01；配对t检验）

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④差异表达的eRNA中，高甲基化区域的大多数eRNA被激活，低甲基化区域的eRNA大多数被抑制。这表明高甲基化是肿瘤发生过程中super-enhancer被激活的一个重要指标。
⑤我们建立了一个网站存放了
1）超级增强子、核心增强子的注释信息学；TCGA、GTEx、CCLE cell line的eRNA表达举证（RPKM）；

2）与免疫治疗反应相关的super-enhancer eRNA loci 和 gene；
3）TCGA数据集中超增强子转录单位与临床结果、体细胞拷贝数改变和CpG甲基化的关系；
4）在>50个ChIA PET或HiC数据集中的3D eRNA位点/启动子相互作用（Wang等人，2018），导致eRNA/靶基因共表达阳性的强烈富集（图S7E–S7H）
5）我们还推断了额外的super-enhancer区域。

五、讨论

①CAGE序列定义的增强子有效但是很局限，主要因为其＞10Kb
②我们通过整合（动态核小体）和来源于（整合过的RNA-seq数据的eRNA表达信号）来识别eRNA loci。其中super -enhancer 具有组织特异性是关键。
③定位良好的核小体具有防止基序接触和避免增强子激活的功能，在大多数组织中，超级增强子是沉默的，一个位置良好的核小体是必要的。这就是为什么我们可以观察到定位良好的核小体与尖锐的eRNA转录峰相吻合。这种定位良好的核小体是高度保守的，表明其在维持超级增强子转录结构中起着重要的作用。

六、方法详细信息

1、超增强子注释

先获取先前所研究的super-enhancer (Hnisz et al.,2013).（hg19所注释得来）；我们从GRCH37 ensembl获取所有外显子注释信息，使用R软件包“biomaRt”从上述超增强子区域移除这些外显子和它们的100 bp序列，以避免已知基因的转录信号污染。然后我们获得了人类基因组基准（Zook等人，2014）排除了对于突变调用或短读映射未明确的基因组区域。只有位于人类基因组基准（benchmark）区域的super-enhancer才用于后续的eRNA表达分析。鉴定出65728super-enhancer，1531个核心-super-enhancer（多个组织中均有表达）

2、eRNA与ChIP-seq H3K27ac信号分析

我们从ENCODE和Cistrome 获取了H3K27ac数据；从ENCODE
和CCLE获取相应的RNA-seq数据。由于Cistrome是用的Hg38注释的，因此我们使用UCSC-liftOver将1531个超级增强子区域从hg19转化为Hg38；
②对于ENCODE ChIP seq样本，每个超级增强子上的H3K27ac水平被定义为在ENCODE bigwig文件中提供的对照的平均折叠变化。我们使用编码RNA序列bigwig文件中超级增强子区域的平均信号作为eRNA表达的读数。
③对于cistrome H3K27ac数据集。bam文件从CCLE获取，每1531个区域的RPM被计算为其eRNA表达的强度。

3、超级增强子eRNA表达谱

4、超级增强子eRNA峰的motif发现和染色质组织

①我们使用具有默认设置的FIMO软件识别29828个核心超增强子峰两侧200 bp区域中由单核苷酸人类基序数据库注释的所有DNA基序，FDR<0.01的FIMO输出被认为是有效的motif。

十、需要掌握的知识

1、GTEx eQTL
GTEx是第一个收集了多个人体器官mRNA测序的数据库
DNA改变是怎么影响mRNA？这一过程被称为Expression quantitative trait loci（eQTL） 分析，目的在于得到单个DNA突变与单个基因表达量之间的相关性。与单个基因mRNA表达量相关的DNA突变，就被称为eQTL。
我们首先通过全基因组测序获得每个个体的DNA全序，然后以同种族的其他个体作为参照，标记出该个体所有的DNA变异位点， 称为SNP位点。同时，我们通过全基因组mRNA表达量测序得到该个体的特定组织样本中的基因表达量。以全部DNA变异位点为自变量，轮流以每种mRNA表达量为因变量，用大量的个体数据做样本进行线性回归，就可以得到每一个SNP位点和每一个mRNA表达量之间的关系。
SNP--单核苷酸多态性--主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上