Chip-Seq&ATAC-Seq 测序分析流程--上游

写在前面

这里我将chip-seq&ATAC-Seq的分析分为了上游和下游两个模块，但是都只是介绍了常规的分析流程。因此，在面对具体课题的下游分析时，仍需要根据自己想要探究的问题进行个性化的分析。

一、介绍

具体的实验方法与流程抽空单独写一节

二、分析流程概述

ATAC-Seq和Chip-Seq都是对特定基因组区域进行的测序方法，在分析流程上有很大的相似性，因此在这一节同时介绍一下两者的分析方法。

分析流程.png

Tips：这里先介绍一下上游的分析流程，在数据的质控和比对方面所有组学均大同小异。

2.1 指控与过滤：trim_galore

trim_galore -j 40 -q 20 --gzip --length 30 -o <输出文件名> --paired <read1.fastq> <read2.fastq> 2>&1 trim.log

2.2 基因组比对：bowtie2

# 1. 创建索引文件
bowtie2-build <fa文件> <索引名 genome> 
# 2. 双端比对
bowtie2 -p 80 -t -N 1 -L 25 -X 2000 --no-mixed --no-discordant -x <索引(位置)名 genome> -1 <干净的read1.fastq> -2 <干净的read2.fastq> | samtools sort -O bam -@ 60 -o <输出文件名> 2>&1 | tee -a bowtie2.log

2.3 去除无用读段（PCR重复 & 线粒体基因组）：sambamba & samtools

在RNA-Seq中，由于一个基因有多个转录本（一个细胞中），难以区分相同的片段究竟是PCR重复还是同一基因的不同转录本，因此不去除相同的reads，但是在Chip-Seq & ATAC-Seq中，一个基因（单拷贝）只有两组基因序列（一个二倍体细胞），因此相同的reads大概率是PCR重复，因此需要去除。
另外，由于大多数细胞中线粒体的染色质可及性都很大，因此在进行ATAC-Seq分析时，通常会将其去除。（如果不关注线粒体基因组，Chip-seq也可将其去除，部分采用Micrococcal酶的Chip-seq技术在实验过程中就会将线粒体基因组切碎。）

# 去除PCR重复
sambamba markdup -r  -t 80 --overflow-list-size 600000 <aliged.bam> <去除PCR重复的aliged.bam> 2>&1 | tee -a  markdup.log
# 去除低质量与线粒体基因组（ATAC-Seq必需）
samtools view -@ 40 -h -q 15 -f 2 <去除PCR重复的aliged.bam> | grep -v chrM | samtools sort -O bam -@ 40 -o <去除PCR重复和线粒体（干净）的aliged.bam>  2>&1 | tee -a  filter.log

2.4 生成可视化输入文件：bamCoverage

将bam文件转化为可以在IGV软件中可视化的bw（覆盖率轨迹）文件，在这一步中可以对数据进行对应的标准化处理。

# 可选择是否对片段进行延伸 -e
# chip-seq
bamCoverage --binSize 100 --normalizeUsing RPKM -p 40 -b <干净的aliged.bam> -o <coverage.bw>

2.5 寻找特性型富集区域（call peak）：macs2

macs2是一种寻找reads特异性富集区域的方法，即寻找蛋白质富集区域（Chip-Seq），染色质开放区域（ATAC-Seq），在鉴定peak富集模式时，有broad domains和narrow peaks两种模式。（具体原理参考官网，有空可以写一篇文章）

# 根据使用的方法选择是否对片段进行延伸，细节注意看官网
# chip-seq: 此处显示的代码用于无对照的chip数据
macs2 callpeak -f BAMPE -g <有效基因组大小> -t <干净的aliged.bam> -n <输出文件名> -q 0.01 --nolambda --nomodel -B --outdir <输出文件位置>

# ATAC-seq: 此处显示的代码用于无对照的ATAC数据，由于atac关注剪切位点，因此可将片段向5‘移动100bp，随后向3’延伸为200bp的片段（--shift -100 --extsize 200）
macs2 callpeak -f BAMPE -g <有效基因组大小> -t <干净的aliged.bam> -n <输出文件名> -q 0.01 --nolambda --nomodel --shift -100 --extsize 200 -B --outdir <输出文件位置>