不要"太重视“fastqc的结果

刘小泽写于19.5.29
原始数据质控永远是好的分析结果的第一步，我们主流都是采用fastqc软件，结果会产生一个html网页，下载下来看看就知道大体的数据质量。但是，其中这么多内容，我都应该相信吗？
答案是NO！因此这里题目用引号也表示强调，不要因为看到summary中出现了几个叉号就对自己的数据不报希望，或者直接无视所有的结果，这样都是不对的，还是要了解自己的数据

1 使用fastqc质控的意义

首先，要知道目前主要使用的二代测序仪主要是Illumina出品，它的特点有两个：桥式扩增和边合成边测序(sequencing-by-synthesis，SBS)

它的第二个特点主要依靠化学反应来完成碱基合成的过程，使得从5‘=》3’可以不断合成延伸。那么既然是化学反应，就一定存在扩增效率减弱的现象(因为聚类酶的活性在降低，导致结合的特异性变差)，因此测序长度越长，后面数据的质量会降低的越厉害

(图片来源：http://www.biofidal-lab.com/details-miseq+illumina+sequencing+system+at+lyon-50.html)

我们知道fastq文件的格式，其中第四列表示碱基质量值，如果要对一条reads求它的质量值(也就是Phred值)，可以利用python的ord()函数(https://www.biostars.org/p/225923/)

这个ord函数将字符转为ASCII对应的数字，然后目前我们大多使用的测序仪都是Phred33标准，再减去这个33，就得到了最后的质量值
python -c 'from math import*; print 10**-((ord("A")-33)/10.0)'

但是，这仅仅是对一条read求解，但是一般一个样本的测序结果就要十几M甚至几十M，也就是几千万条reads，即使用批量处理也很慢，因此fastqc就专门解决这个问题，最后以可视化形式来展现，而且它展示的是全部reads的共同结果，而不是某一条read，方便全局把握数据质量

2 fastqc的结果很多，该看什么？

官网已经很详细的介绍了每部分的含义：http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Help/

这里只是列出一些重点，防止眼花缭乱找不到重点

其实一开始接触这个软件的时候，我还记得当时我是把所有的图都看了一遍，结果除了第一个summary和总体质量值的那张图外，其余都看不懂

好，话不多说，从fastqc结果的第一部分开始看：

首先映入眼帘的是summary，也就是这个软件对你的数据做的所有的事(也就是所有的模块——module)

其中黄色表示Warning，红色表示Fail

不得不说，软件这里做的可能容易产生误导，因为它认为与它的标准相差太大就给红牌罚下，这样对所有的数据"一视同仁"有些武断，最好应该像"挖地雷"游戏中，标记成小旗，让我们知道这里有待商榷就好

2.1 第一个模块 Basic Statistics

样本的基础信息，有用的是箭头标出的部分

2.2 第二个模块 Per base sequence quality

这是最重要的质控模块之一，它描述的是：
Distribution of quality scores at each position in the read across all reads

其中纵轴表示Phred碱基质量，横轴表示碱基在reads上的位置。比如：横坐标的1表示所有reads的第一个碱基的质量值分布，结果用一个箱线图表示。(如果不知道箱线图是什么？搜索一下，比如：https://whatis.techtarget.com/definition/box-plot)。箱线图的红线表示中位数，其余的四条线为10、25、75、90四分位数。

然后又看到有一条贯穿箱线图的蓝色线(看右图差的数据)，它表示平均碱基质量值。

整个图又有三块背景：红色背景区域表示reads质量很差(Phred < 20)，绿色背景表示质量不错(Phred > 28)，因此看到右图中第一个碱基的箱线图中的10分位数也在纵轴的28以上，表示几乎全部的reads的第一个碱基质量值都大于28

不是所有的数据都那么幸运，会出来左边的结果。怕就怕，看到结果差，却不知道为什么差，更不用说从何下手去纠正这个问题了。
因此这里我们不看好的数据，只看差的数据的产生原因是什么

2.2.1 测序错误概览

对于Illumina测序来说，碱基测序质量和荧光信号的强度与纯度有关（signal intensity and purity of the fluorescent signal），因为它后续是用一个非常灵敏的照相机进行拍照。如果检测到的荧光强度太低或者一次检测出现了多种荧光信号，就会导致最后系统判断这个碱基质量值低。

测序错误又分为能预料到的和不能预料的：

• 能预料的错误：也就是我们知道测序仪从第一次扩增cycle到最后一个cycle一定存在下降的趋势，一般导致的因素有：信号减弱(Signal decay)、相位(Phasing)

  • 信号减弱：由于荧光团的降解(之前DNA聚合时每个碱基都是带着荧光基团的，荧光降解当然会识别不出这个碱基)；或者一个簇(cluster)中一定比例的reads没有延长成功(因此越往后，合成放出荧光的"力气"越来越小)

  • 相位：原来为了保证一次只添加一个碱基，会在聚合的碱基中提前加上3' terminators和荧光基团。结合并检测到荧光后，再将这个碱基去掉，进行下一个。但是如果说3' terminators和荧光基团没有成功去除或者说加的3' terminators根本不好用，那么这个碱基就不会被去掉，它会一直向下聚合并发出和原来一样的荧光

    具体原理可以看：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2745764/

    

    可以看到，越到后来的循环，越不容易看到真实的荧光

• 不能预料的错误： 簇的交叉(Overclustering)和仪器运行错误(Instrumentation breakdown)

  • 簇的交叉：当每个扩增簇离得很近，它们可能会通过桥式扩增产生交叉，这原本的两个簇最后会被当成一个簇来解读荧光信号，降低了荧光强度，将整个read质量值降低
  • 仪器问题：比如说reads质量值本来非常好，然后质量值突然呈90度下降；再比如绝大部分都是低质量reads

有个网站记录了许多qc结果差的例子：http://bioinfo-core.org/index.php/9th_Discussion-28_October_2010

2.2.2 第一种坏数据

过去测得越长，越容易出现碱基质量逐步下降这个问题。新的试剂研发（比如聚合酶稳定性更好）缓解了一下这种问题，但同时需求的碱基长度也越来越长。一般认为，质量值中位数降到20以下是要考虑剪切（trim）掉的，因为特别低质量的reads在后续分析中不好修复，反而会引入更大误差

2.2.3 第二种坏数据

像这种突然从好数据急转到坏数据的情况，很有可能是测序仪的问题

那么好，既然我们看了上面👆数据存在问题的几种原因，再回过头来，看看之前右边的这个差的数据

可以看到，质量值是逐渐下降的，到尾部降到最低，可以解释为信号减弱或者相位产生；而由于机器问题可能性不大，因此去掉低质量的reads后还是可以用的

2.3 碱基总体质量值分布 Per sequence quality scores

它的横轴是平均质量分数，纵轴是测序reads数。我们比较希望在低质量区域(也就是x轴前端)没有较大的峰(也就是没有太多的reads)

这个图中可以看到：在质量值为12时有一个小突起，但数量不是特别多，因此问题不大

2.4 read各个位置上碱基比例分布 Per base sequence content

这个图经常会蹦出来FAIL 字眼吓唬我们。因为前10-12bp的碱基是RNA测序文库制备时使用的随机六聚体引物( 'random' hexamer priming）
随机引物是人工合成的随机序列六核苷酸混合物，这些引物可以随机地与 mRNA的任何部位互补，其优点是容易合成完整的cDNA

如果真的是测序随机的话，那么根据A-T配对、G-C配对，就可以得到每个位置的A和T比例应该差不多，GC比例应该差不多。但由于六聚体引物的存在，而且它也并不是真正的"随机"，还是存在一些碱基偏好性的，因此前10-12bp会有较大的波动

我们只要通过这个图，能看出没有特别大的碱基偏好性就好(也就是除了特殊的六聚体引物以外，A-T或C-G的比例差在1%以内就可以)

2.5 GC含量分布图 Per sequence GC content

这个图表示了所有reads的GC分布，一般将中间的峰值和这篇文章（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2909565/）列出的结果进行对比。

这个图理论上应该符合正态分布（也就是钟形曲线），除非有过表达的序列( over-represented sequences)[也就是在正态分布的基础上有一个尖尖的峰]，或者存在其他物种的污染[也就是多个峰]

从这个图中可以看到，这个应该是符合过表达序列的情况，说明要么存在序列污染，要么是有个特别高表达的基因

2.6 重复序列数 Sequence Duplication Levels

这个图可以帮助判断文库的复杂程度，如果PCR扩增次数太多或者起始扩增底物太少，都会降低文库的复杂度。

这个图中可以看到，似乎有大量的重复序列，也就是说文库复杂程度低，可能与某个基因的过表达有关

2.7 过表达序列表 Overrepresented sequences

这个表的作用也非常重要！

它展示了长度至少20bp，数量占总数0.1%以上的reads碱基组成，它可以帮助判断污染(比如：载体、接头序列)

如果上面的GC含量分布图"挂了"，这个表可以帮助我们判断来源，如果是已知的载体或者接头，它会列出来；如果不是，可以复制序列去blast。

比如这里就可以去复制表达最多的第一条序列去blast，然后发现它其实是一个基因，于是可以验证之前的猜想：基因过表达

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