GATK4 最佳实践-生殖细胞突变的检测与识别

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GATK4 对于体细胞突变和生殖细胞突变的检测分别给出了对应的pipeline:

1. Germline SNPs+Indels

2. Somatic SNVs + Indels

本篇主要关注生殖细胞突变的分析流程Germline SNPs+Indels。示意图如下：

图中红色方框部分的从Analysis-Ready Bam 到，主要包括以下4步

1. HaplotyperCaller in GVCF mode

2. ImportGenomicsDB Consolidate GVCFs

3. GenotypeGVCFs

4. Filter Variants by Variabt Recalibration

官网给出了6套用于参考的pipeline

主要分析步骤都差不多，这里我选择第4个通用的流程 ，网址如下

https://github.com/gatk-workflows/gatk4-germline-snps-indels

1.  HaplotyperCaller in GVCF mode

对于每个样本，采用HaplotyperCaller计算突变位点，命令如下

gatk --java-options "-Xmx6G -XX:GCTimeLimit=50 -XX:GCHeapFreeLimit=10" \
    HaplotypeCaller \
    -R ${ref_fasta} \
    -I ${input_bam} \
    -L ${interval_list} \
    -O ${output_filename} \
    -contamination 0 -ERC GVCF

ref_fasta代表参考基因组的fasta文件;input_bam代表预处理阶段产生的 bam文件；interval代表interval list文件，如果指定这个参数，只会输出指定区域的突变信息。对于全基因组测序，不需要这个参数，对于外显子和目的区域捕获测序, 则需要这个参数；output_filename代表每个样本输出的gvcf文件的名字。

2. ImportGenomicsDB Consolidate GVCFs

将所有样本的gvcf文件合并，产生一个总的gvcf文件，命令如下：

gatk --java-options -Xmx2G  \
    MergeVcfs \
    --INPUT ${sep=' --INPUT ' input_vcfs} \
    --OUTPUT ${output_filename}

3. GenotypeGVCFs

包括两个步骤，第一步，导入MergeVcfs合并好的gvcf文件， 命令如下

gatk --java-options "-Xmx4g -Xms4g" \
    GenomicsDBImport \
    --genomicsdb-workspace-path ${workspace_dir_name} \
    --batch-size ${batch_size} \
    -L ${interval} \
    --sample-name-map ${sample_name_map} \
    --reader-threads 5 \
    -ip 500

workspace_dir_name代表输出目录;batch_size指定同时访问的最大文件数，默认值为0，表示同时访问所有样本的文件；interval代表interval list文件，如果指定这个参数，只会输出指定区域的突变信息。对于全基因组测序，不需要这个参数，对于外显子和目的区域捕获测序, 则需要这个参数；sampple_name_map是一个文件，记录了样本名称和每个样本对应的gvcf文件的路径。格式如下

sample1      sample1.vcf.gz
sample2      sample2.vcf.gz
sample3      sample3.vcf.gz

第二步， 运行GenotypeGVCFs，命令如下

gatk --java-options "-Xmx5g -Xms5g" \
    GenotypeGVCFs \
    -R ${ref_fasta} \
    -O ${output_vcf_filename} \
    -D ${dbsnp_vcf} \
    -G StandardAnnotation \
    --only-output-calls-starting-in-intervals \
    --use-new-qual-calculator \
    -V gendb://$WORKSPACE \
    -L ${interval}

需要注意-V 参数，指定的是GenomicsDBImport输出目录的路径。

4. Filter Variants by Variabt Recalibration

第一步，过滤vcf文件，条件为ExcessHet大于给定的阈值，命令如下：

gatk --java-options "-Xmx3g -Xms3g" \
    VariantFiltration \
    --filter-expression "ExcessHet > ${excess_het_threshold}" \
    --filter-name ExcessHet \
    -O ${variant_filtered_vcf_filename} \
    -V ${vcf}

excess_het_threshold指定ExcessHet的阈值；variant_filtered_vcf_filename代表输出的vcf文件的名字；vcf代表GenotypeGVCFs 生成的vcf文件的名字。注意，不满足条件的记录也会出现在最终生成的vcf文件中, 只不过对应的Filter字段的信息不是PASS。

第二步，删除vcf文件中的基因型信息，命令如下

gatk --java-options "-Xmx3g -Xms3g" \
    MakeSitesOnlyVcf \
    --INPUT ${variant_filtered_vcf_filename} \
    --OUTPUT ${sites_only_vcf_filename}

第三步，合并不同区间的vcf文件，并建立索引

gatk --java-options "-Xmx6g -Xms6g" \
  GatherVcfsCloud \
  --ignore-safety-checks \
  --gather-type BLOCK \
  --input ${inputs.list} \
  --output ${output_vcf_name}
gatk --java-options "-Xmx6g -Xms6g" \
   IndexFeatureFile \
   --feature-file ${output_vcf_name}

output_vcf_name代表输出的vcf文件；inputs.list指定不同区间的vcf文件的路径，格式如下

cohortA_chr1.vcf.gz
cohortA_chr2.vcf.gz

第四步，分别评估SNP和INDEL突变位点的质量, 命令如下

gatk --java-options "-Xmx24g -Xms24g" \
    VariantRecalibrator \
    -V ${sites_only_variant_filtered_vcf} \
    -O ${recalibration_filename} \
    --tranches-file ${tranches_filename} \
    --trust-all-polymorphic \
    -tranche ${sep=' -tranche ' recalibration_tranche_values} \
    -an ${sep=' -an ' recalibration_annotation_values} \
    -mode INDEL \
    --max-gaussians 4 \
    -resource mills,known=false,training=true,truth=true,prior=12:${mills_resource_vcf} \
    -resource axiomPoly,known=false,training=true,truth=false,prior=10:${axiomPoly_resource_vcf} \
    -resource dbsnp,known=true,training=false,truth=false,prior=2:${dbsnp_resource_vcf}
gatk --java-options "-Xmx100g -Xms100g" \
      VariantRecalibrator \
      -V ${sites_only_variant_filtered_vcf} \
      -O ${recalibration_filename} \
      --tranches-file ${tranches_filename} \
      --trust-all-polymorphic \
      -tranche ${sep=' -tranche ' recalibration_tranche_values} \
      -an ${sep=' -an ' recalibration_annotation_values} \
      -mode SNP \
      --sample-every-Nth-variant ${downsampleFactor} \
      --output-model ${model_report_filename} \
      --max-gaussians 6 \
      -resource hapmap,known=false,training=true,truth=true,prior=15:${hapmap_resource_vcf} \
      -resource omni,known=false,training=true,truth=true,prior=12:${omni_resource_vcf} \
      -resource 1000G,known=false,training=true,truth=false,prior=10:${one_thousand_genomes_resource_vcf} \
      -resource dbsnp,known=true,training=false,truth=false,prior=7:${dbsnp_resource_vcf}

resource指定建模时参考的vcf文件，可以看到对于indel和snp, 参考的数据库不一样。这一步只是建模，会输出一个recalibration table文件，用于ApplyVQSR命令。

第五步，运行VQSR, 命令如下

gatk --java-options "-Xmx5g -Xms5g" \
    ApplyVQSR \
    -O tmp.indel.recalibrated.vcf \
    -V ${input_vcf} \
    --recal-file ${indels_recalibration} \
    --tranches-file ${indels_tranches} \
    --truth-sensitivity-filter-level ${indel_filter_level} \
    --create-output-variant-index true \
    -mode INDEL
gatk_path --java-options "-Xmx5g -Xms5g" \
    ApplyVQSR \
    -O ${recalibrated_vcf_filename} \
    -V tmp.indel.recalibrated.vcf \
    --recal-file ${snps_recalibration} \
    --tranches-file ${snps_tranches} \
    --truth-sensitivity-filter-level ${snp_filter_level} \
    --create-output-variant-index true \
    -mode SNP

input_vcf文件为GatherVcfsCloud生成的vcf文件，先校正INDEL位点，后校正SNP位点。

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