王炸组合『单细胞+空间转录组』的科研应用【2】：肝脏生理学/疾病
王炸组合『单细胞+空间转录组』的科研应用【1】：心血管发育/疾病
02 肝脏生理学/疾病
最近的技术进步使得在单个细胞中进行全基因组RNA分析成为可能，这种技术被称为单细胞转录组测序（scRNA-seq）。肝脏组织的scRNA-seq主要包括肝脏组织被解离，单细胞被捕获，RNA测序等工作流程。
scRNA-seq工作流程的主要步骤和最常用技术的比较
使用scRNA-seq研究肝脏病理生理学
单细胞水平的肝脏生理学研究
> 从单细胞数据中收集空间信息来研究肝脏的分区情况
scRNA-seq最早的应用之一是研究小鼠和人类的肝脏分区。使用scRNA-seq研究肝脏生理学的一个主要挑战是单个细胞RNA数据与空间信息的整合。为了克服这一障碍，已经开发了特定的测序策略和生物信息学分析方法，使人们对肝脏分区有了新的认识。在相关研究中，研究人员通过结合scRNA-seq和单分子RNA荧光原位杂交（smRNA-FISH）来进行空间分辨率的RNA测序，研究了小鼠肝脏分区。
空间转录组学和将scRNA-seq数据与空间信息相匹配的策略
一旦已知某一细胞类型的空间转录本数据，成对细胞测序可以推断其他细胞类型的分区，并确定细胞间的强相互作用。当表面蛋白可用作空间标记时，利用FACS进行空间分类可用于对特定区域的细胞进行分类。Combining >−2个反向分区标记，可以从特定的肝小叶区域对细胞进行分选，不仅有利于scRNA-seq，而且有利于多组学分析。对空间分选的肝细胞进行蛋白质组学和RNA-seq检测，可以绘制蛋白质分区图谱，以及特定肝区中基因表达与蛋白质表达的相关性。
当空间组织是组织异质性的主要来源时，计算分析也有助于从scRNA-seq数据推断空间信息。例如研究人员应用扩散伪时分析来模拟健康人肝脏中肝细胞和肝窦内皮细胞（LSECs）的分区。该计算分析：1）首次在单基因水平上对人肝细胞和LSECs的门中区划进行了剖析；2）证明LSEC基因具有高度区划性；3）证明肝细胞和LSECs都具有非单调区划模式的基因。超过60%的LSEC基因被发现是分区的。
从scRNA-seq研究中得出肝脏分区的新概念
最近发展了更复杂的计算算法，可以从scRNA-seq数据推断空间信息，例如NovoSpaRc，允许在有或没有使用已知空间信息和标记基因的情况下重新构建单细胞基因表达图谱。
从标准scRNA-seq数据推断空间信息的挑战之一是需要通过直接的空间技术（如免疫组织化学、免疫荧光或FISH）进行后续验证。为了克服这个问题，最近开发了原位空间转录组学的系统。
原位空间转录组模型
> 利用scRNA-seq鉴定肝脏发育和再生过程中的祖细胞
再生是肝脏生理学的重要特征之一，但肝胆前体细胞的确切身份和异质性程度尚未完全明确。数据主要来源于小鼠模型，根据损伤模型和实验背景，提出不同的祖细胞群（从胆道样祖细胞到分化的肝细胞）是肝脏上皮再生反应的主要来源。scRNA-seq有助于研究罕见的细胞类型，最近被用于研究胎儿和成人肝脏中肝胆前体的异质性和信号通路。目前的多项研究表明scRNA-seq促进了在胎儿和正常成人肝脏中发现EPCAM+区间的双能祖细胞，其激活与YAP靶基因的上调有关。为了准确地描述人类疾病中肝脏再生的驱动因素，需要进一步分析专注于慢性和急性损伤后人类肝脏中的祖细胞群。
通过scRNA-seq发现正常人肝脏中的双能祖细胞
对慢性肝病和癌症微环境的新见解
> 慢性肝病和肝硬化中非实质细胞的表型
由肝细胞和肝非实质细胞（NPCs）组成的肝脏微环境在所有慢性肝病的发病机制中起着关键作用。为了应对慢性肝细胞损伤，免疫细胞产生促炎细胞因子和趋化因子，并激活静止的肝星状细胞（HSCs），这些细胞成为肌成纤维细胞，负责胶原蛋白和细胞外基质的积累--这是肝脏纤维化的标志。这种肝脏免疫失调在不同形式的慢性肝病中很常见，并引发细胞应激和死亡、细胞凋亡、肝纤维化以及肝细胞增殖和肝脏再生。已有单细胞研究揭示了慢性肝病和肝硬化中NPCs的异质性和复杂的细胞间相互作用。
> 肝内皮细胞参与多种细胞间相互作用以及循环单核细胞向肝巨噬细胞的初次分化
对健康小鼠和饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）-胰淀素[AMLN]模型小鼠的NPC进行单细胞研究，研究重点为NPC分泌组的特征和细胞间的相互作用。发现LSECs可分泌血管分泌因子并表达多种参与细胞间相互作用的基因。胆管细胞、HSCs和LSECs表达配体，提示与其他NPCs有广泛的相互作用和自分泌信号。在NASH肝脏中，LSECs上调了与脂质代谢、趋化因子释放和抗原呈递有关的基因的表达，而与血管稳态和血管发育有关的基因则下调，诱导了窦状毛细血管的显著破坏。
LSECs是单核细胞和其他骨髓源性细胞进入肝小叶的入口。LSEC与单核细胞的相互作用在决定循环单核细胞的命运以及它们向肝巨噬细胞的分化中至关重要。小鼠模型的单细胞分析表明，在NASH肝脏中，单核细胞衍生的巨噬细胞扩张，具有独特的炎症表型。是否NASH-LSECs失调决定了NASH单核细胞来源的巨噬细胞的表型仍然是未知的，需要进一步的研究来阐明LSECs与单核细胞在NASH发病机制中的相互作用。
>肝星状细胞在空间和功能上呈带状分布，是自分泌和旁分泌信号的中枢
HSCs以前被认为代表了一个功能上同质的群体。研究人员利用scRNA-seq对健康和纤维化小鼠肝脏的肝脏间质进行解旋，揭示了HSCs在肝小叶的空间分区。来自小鼠肝脏的scRNA-seq也表明，HSCs特异性分泌细胞因子，通过分泌神经生长因子作用于LSECs、巨噬细胞和胆管细胞，调节纤维化途径、细胞因子表达、血管活性激素信号和HSC凋亡。NASH中HSCs单细胞分析表明，它们上调IL-11和细胞因子，并调节LSECs和巨噬细胞的功能，提示其双向作用更为复杂。总之，HSCs的单细胞分析进一步扩展了这一概念，即这种细胞类型在正常和病变肝脏中作为肝脏NPCs旁分泌/自分泌网络的中心枢纽。
>纤维化生态位中的巨噬细胞表型和非实质细胞相互作用
在平衡状态下，肝脏不断接触来自肠道的病原体和毒素；肝脏清除大量的微生物和微生物相关分子，以维持耐受和免疫抑制的环境。人类肝脏单细胞图谱的数据显示，正常肝脏不仅含有具有代谢和清道夫功能的免疫调节巨噬细胞，还含有促炎巨噬细胞。scRNA-seq揭示了新的瘢痕相关的巨噬细胞、内皮细胞和间充质细胞亚群，这些亚群存在于肝硬化的纤维化生态位中；这揭示了这些不同类型的细胞如何相互作用促进纤维化。肝硬化纤维化是一个高度复杂的过程，其特征是处于不同分化和激活状态的多种不同细胞系相互作用。开发新的抗纤维化治疗方法需要考虑纤维化生态位的复杂性；治疗可能需要同时调节多个治疗靶点以达到抗纤维化的效果。
肝纤维化生态位中的细胞间配体-受体相互作用
阐明原发性肝癌内肿瘤微环境和异质性
scRNA-seq有助于描述HCC微环境中各种细胞类型的表型，并阐明了癌上皮细胞和TME之间的相互作用。HCC是一个复杂的细胞生态系统，包括clonal Tregs、clonal CD8+LAYN+exhausted T 细胞、pre-exhausted CD8+GZMK+细胞、LAMP3+DC、骨髓源性抑制细胞、TAM样巨噬细胞和PLVAP+内皮细胞，这些细胞类似于居住在肝纤维化生态位的内皮细胞。scRNA-seq和空间转录组学方法将有助于我们进一步了解TME的细胞和分子调控机制，进而有助于确定肝胆癌的新治疗靶点。此外，这些方法还应为更精确的肿瘤分类和患者分层提供信息，从而完善该领域的临床试验设计。
利用scRNA-seq研究肝细胞癌的肿瘤微环境
scRNA-seq已经在对肝脏分区、再生以及慢性肝病和癌症生物学的理解上有了新的变革性发现。肝病生物学涉及多种细胞类型和复杂的细胞间相互作用，而scRNA-seq可以详细研究这些多细胞的微环境。目前的挑战是如何充分利用并将这些新知识转化为有效的新型治疗方法，以解决肝病学的主要临床挑战。
首发公号：国家基因库大数据平台
参考文献
Saviano A, Henderson N C, Baumert T F. Single-cell genomics and spatial transcriptomics: discovery of novel cell states and cellular interactions in liver physiology and disease biology[J]. Journal of hepatology, 2020.
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